基于扎伊爾埃博拉病毒包膜蛋白的新抗原片段篩選及rVSV載體疫苗的構(gòu)建.pdf

1、埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)是烈性傳染病埃博拉出血熱(EHF)的病原體，屬于A類生物戰(zhàn)劑，有可能用于生物戰(zhàn)及生物恐怖襲擊。感染Ebola病毒后，相關(guān)疾病發(fā)展進(jìn)程快，難以及時產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)。迄今為止，沒有有效的疫苗及藥物可用于埃博拉病毒感染的預(yù)防及臨床治療。目前，基于rAD5(recombinant Adenovirus5)載體與rVSV(recombinant vesicular stomatitisviru

2、s)載體且表達(dá)埃博拉病毒包膜蛋白(Glycoprotein，GP)的疫苗在非人靈長動物模型(nonhuman primate，NHP)中獲得了良好的保護(hù)活性。rAD5載體疫苗的主要問題是預(yù)存免疫，導(dǎo)致該疫苗較高的免疫劑量與較長的免疫周期。而rVSV載體疫苗則不存在預(yù)存免疫問題，能夠快速誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫反應(yīng)并具有一定的病毒感染后治療作用，而且在采取不同亞型病毒疫苗聯(lián)合免疫時能夠在NHP模型中產(chǎn)生有效的交叉保護(hù)作用。然而，進(jìn)行單價疫苗聯(lián)合免

3、疫策略研究時，需要制備各個單價疫苗并對其免疫活性進(jìn)行評價，制備成本較高且較為繁瑣。而rVSV載體的插入基因上限為4.5kb，限制了基于單個載體構(gòu)建表達(dá)多個亞型病毒GP蛋白的多價疫苗的可行性。
　　鑒于rVSV載體疫苗在對抗多亞型病毒感染及感染后保護(hù)作用的優(yōu)勢，本論文開展多價rVSV疫苗研究。根據(jù)扎伊爾型埃博拉病毒包膜蛋白GP的抗原表位分布以及結(jié)構(gòu)功能，設(shè)計了三個小片段抗原(GP1ΔM，MLD，L)，利用pVAX1重組質(zhì)粒免疫BAL

4、B/c小鼠，通過各抗原片段的體液免疫反應(yīng)水平確定了優(yōu)選抗原片段L（GP蛋白的aa393-556序列）。利用GP、L重組蛋白免疫小鼠，進(jìn)一步確認(rèn)抗原片段L的免疫原性，然后鑒定其抗原決定區(qū)。由于來自于口蹄疫病毒的2A序列(FMDV-2A)與蛋白共表達(dá)時可自動裂解為蛋白單體，我們應(yīng)用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建包含F(xiàn)MDV-2A自裂解序列、蘇丹型埃博拉病毒包膜蛋白序列以及扎伊爾博拉病毒包膜蛋白片段L的rVSVΔG載體二價疫苗，并免疫Balb/c小鼠，

5、評價了二價疫苗的免疫原性。主要研究結(jié)果如下:
　　1.小片段抗原L具有高免疫原性，產(chǎn)生的抗體具有中和活性
　　(1)位于Zaire-GP連接區(qū)域(aa393-556)的片段L能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)與有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)
　　我們選取了毒力最強(qiáng)的扎伊爾型埃博拉病毒包膜蛋白GP作為抗原篩選工作的基礎(chǔ)，根據(jù)GP蛋白的抗原表位分布以及結(jié)構(gòu)功能，設(shè)計了3個小片段抗原(GP1ΔM，MLD，L)，構(gòu)建pVAX1重組質(zhì)粒并免疫BAL

6、B/c小鼠。結(jié)果表明，經(jīng)3次免疫后，pVAX1-L免疫組血清抗體水平與pVAX1-GP免疫組相當(dāng)，明顯高于pVAX1-GP1ΔM免疫組與pVAX1-MLD免疫組，而且pVAX1-L免疫組血清中IgG2a/IgG1的水平與pVAX1-GP免疫血清一致，說明抗原片段L具有與GP相當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的能力，且優(yōu)于片段GP1ΔM與MLD。GP及片段L重組蛋白免疫小鼠3次（10、24、38天）的結(jié)果表明，蛋白L各次免疫的血清抗體水平均與蛋白GP

7、一致，進(jìn)一步證明L片段誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)水平與GP相當(dāng)。在細(xì)胞免疫反應(yīng)水平方面，蛋白L免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖水平以及IL-2、IFN-γ分泌水平均明顯高于生理鹽水對照組，但低于蛋白GP免疫組，說明L片段能夠誘導(dǎo)一定程度的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　(2)L片段能有效誘導(dǎo)中和抗體的分泌
　　利用假病毒模型測定GP、L片段免疫血清中的中和抗體水平。結(jié)果表明，L片段免疫血清與GP免疫血清對假病毒感染的抑制率之間沒有顯著性差異，說明二者免

8、疫血清中的中和抗體水平基本一致，進(jìn)一步證明了L片段具有不弱于GP的免疫原性。
　　(3)L片段的主要抗原決定區(qū)位于包括furin位點(diǎn)與內(nèi)部融合環(huán)的區(qū)域（GP蛋白的aa479-556）
　　根據(jù)L片段不同區(qū)域的結(jié)構(gòu)與功能，將其進(jìn)一步劃分為3個小片段LA(aa393-479)，LM(aa436-519)，LB(aa480-556)，構(gòu)建pVAX1重組質(zhì)粒并免疫BALB/c小鼠后測定血清中的抗體水平。結(jié)果表明，經(jīng)3次免疫后，LM、

9、LB片段免疫血清中的抗體水平與L相比沒有顯著性差異，而LA片段免疫血清抗體水平則明顯低于L免疫組。此外，LM、LB免疫血清對假病毒感染的抑制率與L免疫血清基本一致，即LM、LB能夠有效誘導(dǎo)中和抗體的分泌，而LA則不能有效抑制假病毒的感染，其抑制率與空載體免疫血清基本一致。上述結(jié)果表明，L片段的主要抗原決定區(qū)包括除LA外的其他區(qū)域，即包括furin位點(diǎn)與內(nèi)部融合環(huán)的序列（GP蛋白的aa479-556）。
　　2.基于FMDV-2A自

10、裂解序列與rVSV載體的二價疫苗rVSVΔG-SGP-2A-L可有效誘導(dǎo)針對Zaire-GP與Sudan-GP的交叉免疫反應(yīng)
　　為驗(yàn)證基于FMDV-2A自裂解序列與rVSV載體構(gòu)建重組二價疫苗的可行性，我們進(jìn)行了表達(dá)Sudan-GP與L兩種抗原組分的rVSV載體重組二價疫苗rVSVΔG-SGP-2A-L的構(gòu)建與包裝。首先利用FMDV-2A自裂解序列構(gòu)建Sudan-GP與該抗原片段的融合基因，克隆接入pVSVΔG載體中構(gòu)建二價疫苗

11、載體，通過反向遺傳操作技術(shù)進(jìn)行重組疫苗rVSVΔG-SGP-2A-L的包裝，同時也完成了對照單價疫苗rVSVΔG-ZGP與rVSVΔG-SGP的包裝。將獲得的重組疫苗感染BHK21細(xì)胞，裂解細(xì)胞后進(jìn)行western blot分析以鑒定各抗原成分的表達(dá)效率。結(jié)果表明，重組疫苗感染BHK21細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)明顯的CPE效應(yīng)，并且能有效表達(dá)各抗原成分，其中rVSVΔG-SGP-2A-L表達(dá)的融合抗原SGP-2A-L能夠有效裂解為單獨(dú)的抗原Sud

12、an-GP與L，并能夠有效誘導(dǎo)針對Zaire-GP與Sudan-GP的交叉免疫反應(yīng)，其IgG抗體水平及中和抗體水平與rVSVΔG-ZGP+rVSVΔG-SGP聯(lián)合疫苗相當(dāng)，提示利用FMDV-2A序列及抗原片段L能夠構(gòu)建有效的rVSV載體多價疫苗。
　　綜上所述，抗原片段L具有與Zaire-GP相當(dāng)?shù)拿庖咴?，能夠有效誘導(dǎo)中和抗體的分泌，位于furin位點(diǎn)及內(nèi)部融合環(huán)的序列是L片段的主要抗原決定區(qū)，基于rVSVΔG載體與FMDV-2