高變區(qū)1抑制丙型肝炎病毒包膜蛋白E2誘生交叉中和抗體.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）屬于黃病毒科，主要經(jīng)血液傳播，是引起人類丙型肝炎的病原體。全球約有1.7億人感染HCV，每年新增感染者達300萬-400萬。我國HCV感染者估計近4000萬。HCV感染易慢性化，其慢性化率可高達85％，部分慢性丙型肝炎患者可發(fā)展為肝硬化，甚至肝細胞癌。目前主要采用聚乙二醇干擾素α聯(lián)合利巴韋林治療丙型肝炎，其效果明顯受HCV基因型影響。2、3型HCV感染對該療法的持續(xù)病毒學應答率（

2、SVR）可達到75％，但1型HCV感染的SVR不到50％。目前全球范圍內(nèi)經(jīng)血液以及血制品途徑感染的丙型肝炎病例與上世紀九十年代以前相比有大幅下降，但在發(fā)展中國家血液和血制品仍然是傳播HCV的重要途徑。此外，每年散發(fā)性以及傳播途徑不明的丙型肝炎新發(fā)病例仍高居不下?？刂艸CV感染的關鍵措施還是依賴于開發(fā)出有效的疫苗，從1989年HCV基因組被克隆以來，丙型肝炎疫苗的研究在歐美和日本等發(fā)達國家一直是研究熱點，但迄今未有有效的疫苗問世。

3、　　 HCV包膜蛋白E2位于HCV蛋白前體第384-746位氨基酸殘基，由一個大的N端膜外區(qū)和一個C端疏水錨定區(qū)組成，與HCV另一包膜蛋白E1通過非共價鍵形成異源性二聚體。E2蛋白是介導病毒吸附和進入宿主細胞的關鍵蛋白，是誘導宿主產(chǎn)生HCV中和抗體的關鍵抗原，因此是疫苗研究的最主要靶標。然而，包膜蛋白高度變異，尤其E2蛋白氨基末端的含有27個氨基酸殘基的高變區(qū)1（hypervariable region1，HVR1）是HCV蛋白中變異

4、頻率最高的區(qū)域，也是公認的HCV中和抗體表位所在區(qū)域。HVR1是介導HCV與受體SR-BI結合的關鍵區(qū)域，HVR1與SR-BI的作用通過幾種不同的機制促進HCV細胞侵入。HVR1抗體和SR-BI抗體均能阻斷HCV感染。HVR1的高度變異曾被認為是遏制丙肝疫苗發(fā)展的瓶頸問題，近幾年來基于HCV假病毒（HCVpp）以及細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV（HCVcc）的中和試驗發(fā)現(xiàn)，HVR1并不是唯一的中和抗體表位所在區(qū)域，在HCV包膜E2蛋白中還存在一系

5、列構象依賴的中和表位和線性中和表位，其中一些表位在不同基因型、亞型間高度保守。
　　 本實驗室前期分別用分泌表達E2的表達質粒以及刪除了HVR1的E2表達質粒免疫小鼠，然后檢測、分析小鼠血清中的抗體以及病毒中和活性，結果顯示：E2質粒免疫的小鼠血清中，HVR1抗體在總E2抗體中占很大比重，針對HVR1以外區(qū)域的抗體在中E2抗體中只占較小比重；刪除HVR1可顯著增強E2質粒免疫誘導的針對HVR1以外區(qū)域的抗體，小鼠免疫血清與其他基

6、因型E2蛋白的交叉反應以及對其他基因型HCVpp的交叉中和活性也隨之顯著增強。這和急性HCV感染者血清中可檢測到HVR1抗體而難以檢測到E2抗體相似。結果提示：HVR1有可能抑制E2蛋白中保守表位的免疫原性，從而從另一個方面導致HCV免疫逃避。目前基于HCV包膜蛋白為主要靶抗原的疫苗均含有HVR1，這類疫苗免疫黑猩猩只能抵抗同株病毒攻擊，但不能抵抗異株的攻擊。HVR1的存在可能是這類疫苗免疫保護效果不理想的重要原因，刪除HVR1也許能增

7、強疫苗免疫對異株病毒攻擊的保護效果。
　　 核酸疫苗在大動物的免疫效果遠遠不及在小動物的免疫效果，目前還沒有核酸疫苗用于人類。為了進一步探討用刪除了HVR1的包膜E2蛋白作為HCV疫苗的發(fā)展前景，本研究用CHO細胞表達了E2以及刪除了HVR1的E2蛋白，用親和層析純化出了兩種E2蛋白，分析兩種E2蛋白的構象、受體結合功能和抗原性，通過小動物免疫分析HVR1對E2蛋白免疫原性的影響，與我們用核酸免疫獲得的結果進行對比和驗證，探討缺

8、失HVR1的E2蛋白在丙肝疫苗中的應用前景。
　　 一、穩(wěn)定表達HCV包膜E2-人IgG Fc融合蛋白的CHO細胞株的建立
　　 二、E2-Fc、E2Δ-Fc融合蛋白純化及功能鑒定
　　 三、刪除HVR1增強E2-Fc融合蛋白的免疫原性
　　 小結：本研究著眼于丙型肝炎病毒蛋白疫苗的開發(fā)思路，在前期DNA免疫的基礎上，構建了穩(wěn)定表達E2-Fc/E2Δ-Fc的無蛋白無血清懸浮CHO細胞培養(yǎng)體系并成功純化出相