登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)中和抗體的功能及結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、登革病毒(Dengue Virus，DENV)是一種通過蚊子（以埃及伊蚊和白紋伊蚊為主）傳播的病毒，屬于黃病毒屬的黃病毒科。DENV含有四個(gè)血清型:DENV1，DENV2，DENV3及DENV4。各種血清型的DENV之間存在60-70％的同源序列。人類感染了DENV的其中任何一種血清型后將引發(fā)從輕度自限性登革熱(Dengue Fever, DF)到重度甚至死亡的登革出血熱(Dengue HemorrhagicFever，DHF)及登革休

2、克綜合征(Dengue Shock Syndrome，DSS)。目前，對(duì)于登革熱的研究已經(jīng)持續(xù)進(jìn)行了60多年，仍然沒有安全有效的疫苗及治療藥物得以認(rèn)證使用，因而近年來登革熱已逐漸成為影響全球熱帶及亞熱帶地區(qū)的主要公共衛(wèi)生問題。每年世界上大約有5000萬-1億人感染DENV，其中大約50萬人會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥從而引發(fā)2.5萬人死亡。機(jī)體初次感染任一血清型的DENV所誘發(fā)的抗體能夠中和同一血清型的再次感染，但是當(dāng)機(jī)體再次感染其他三種不同的血

3、清型時(shí)，此異型中和抗體會(huì)促進(jìn)Fcγ受體陽性細(xì)胞內(nèi)病毒的攝入及復(fù)制，引發(fā)抗體依賴增強(qiáng)作用(antibody-dependent enhancement，ADE)，從而誘發(fā)登革熱嚴(yán)重的并發(fā)癥如DHF/DSS等。ADE作用的存在是登革熱疫苗研發(fā)的主要障礙。因此，如果能夠?qū)贵w誘導(dǎo)中和作用的機(jī)制及抗原位點(diǎn)有了全面深入的理解，對(duì)于疫苗的研發(fā)策略以及臨床試驗(yàn)中疫苗效果及安全性的評(píng)估有著非常重要的意義。DENV是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組

4、長度大約11kb，編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。三種結(jié)構(gòu)蛋白分別是衣殼蛋白(capsid protein，C)，膜蛋白(membrane protein，M)和包膜蛋白(envelope protein，E)。7種非結(jié)構(gòu)蛋白分別為NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。E蛋白是成熟DENV顆粒表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白，作為宿主體液免疫應(yīng)答的主要抗原靶標(biāo)，在受體的結(jié)合及病毒與細(xì)胞膜融合中起著關(guān)鍵性的作用。在病毒進(jìn)入宿

5、主細(xì)胞的過程中，內(nèi)涵圖環(huán)境的酸性化觸發(fā)了病毒表面的E蛋白二聚體發(fā)生構(gòu)象變化成為三聚體，該變化誘發(fā)了病毒與宿主細(xì)胞膜的融合，最終使得DENV的RNA基因組釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并啟動(dòng)了病毒的感染。目前人們已經(jīng)通過結(jié)晶學(xué)(Crystallography)技術(shù)對(duì)蟲媒病毒及蜱傳腦炎的E蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)學(xué)分析，病毒顆粒表面的E蛋白含有3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū):位于中心的Ⅰ區(qū)(EDⅠ);含有融合環(huán)（fusion peptide，F(xiàn)P）的延展Ⅱ區(qū)(EDⅡ);以及呈免疫球蛋白

6、樣折疊的含有10個(gè)β-strands(A-G及AxCxDx)的EDⅢ。其中EDⅢ作為一個(gè)獨(dú)立暴露于病毒表面的區(qū)域，成為了制備保護(hù)性單克隆抗體的重要抗原靶標(biāo)，相關(guān)研究亦表明EDⅢ含有非常重要的中和抗原表位。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，我們用雜交瘤技術(shù)制備了一組抗DENV1-4 EDⅢ的單抗，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)(immunofluores

7、cence assay，IFA)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(western blot，WB)對(duì)這些單抗的免疫反應(yīng)性進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上，借助已經(jīng)建立的中和實(shí)驗(yàn)方法學(xué)enzyme-linked immunospot based micro-neutralization test(ELISPOT-MNT)對(duì)單抗的中和活性進(jìn)行檢測(cè)，其中2株具備針對(duì)DENV1-4較高交叉中和活性的單抗3E31及2D73被選用進(jìn)行下一步的功能和結(jié)構(gòu)學(xué)分析以期能夠?qū)@2株中

8、和抗體的中和作用機(jī)制進(jìn)行全面深入的了解。由此，本研究的目的主要有三個(gè)，一、尋求一種能夠精確滴定DENV的新方法為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備;二、通過一些功能實(shí)驗(yàn)對(duì)交叉中和抗體進(jìn)行分析;三、借助結(jié)晶學(xué)技術(shù)，從結(jié)構(gòu)上分析2株交叉中和抗體的中和作用機(jī)制，為登革熱疫苗及治療性藥物的研發(fā)提供幫助。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：建立基于ELISA的TCID50方法學(xué)(TCID50-ELISA)滴定DENV。在對(duì)于DENV的研究中，常常因?yàn)椴?/p>

9、能準(zhǔn)確地滴定DENV而受到了阻礙，目前人們建立的DENV滴定方法包含噬斑實(shí)驗(yàn)(plaque assay，PA)，半數(shù)組織感染量測(cè)定(tissue cultureinfectious dose-50 assay，TCID50)，熒光焦點(diǎn)實(shí)驗(yàn)以及基于免疫熒光的熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。作為DENV滴定的金標(biāo)準(zhǔn)，PA及TCID50方法均受到了病毒株的傳代及細(xì)胞系的種類的限制，很多DENV臨床分離株并不能在單層細(xì)胞上形成噬斑或者肉眼可見的

10、細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，影響了滴定結(jié)果的判斷。另外，這兩種方法均需要實(shí)驗(yàn)者每天借助顯微鏡進(jìn)行人工檢測(cè)，耗時(shí)耗力。而相比之下熒光焦點(diǎn)實(shí)驗(yàn)及FACS能夠更精確快速地進(jìn)行病毒滴定，缺點(diǎn)是該兩種方法需要具備豐富經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)者及較好的實(shí)驗(yàn)室條件。因而，在我們的研究的最初，為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，試圖建立一種全新的DENV滴定方法學(xué)以克服傳統(tǒng)方法的缺陷。NS1蛋白是DENV的一種多功能糖蛋白，也是DENV復(fù)制的主要

11、標(biāo)志，其主要以分泌及膜表達(dá)兩種方式存在，其中分泌的NS1被認(rèn)為和上清中DENV的滴度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中建立了一種NS1抗原捕獲ELISA方法，在本研究中，我們?cè)趥鹘y(tǒng)的TCID50方法學(xué)的基礎(chǔ)上，借助已經(jīng)建立的NS1抗原捕獲ELISA檢測(cè)病毒感染上清中的NS1蛋白，以替代傳統(tǒng)方法學(xué)中的肉眼觀察CPE，經(jīng)過分析比較后證實(shí)這種TCID50-ELISA方法具備較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，且操作簡(jiǎn)便，能夠替代傳統(tǒng)的TCID50-CPE及PA方

12、法學(xué)進(jìn)行DENV的滴定。
　　 第二部分：四型交叉抗DENV EDⅢ單克隆抗體的功能鑒定。在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，借助畢赤酵母真核表達(dá)體系表達(dá)DENV1-4 EDⅢ重組蛋白，隨后利用雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備了一組抗DENV1-4 EDⅢ的單抗，并對(duì)該組抗體的血清型、交叉反應(yīng)性及中和活性進(jìn)行了鑒定。最終發(fā)現(xiàn)其中2株交叉反應(yīng)性單抗具備針對(duì)DENV四個(gè)血清型較高的中和活性，命名為3E31及2D73。在本研究中，我們通過一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)

13、3E31及2D73的功能進(jìn)行全面的鑒定。首先我們用表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance，SPR)對(duì)2株抗體與DENV1-4 EDⅢ及DENV1-4 E的親和力進(jìn)行了進(jìn)一步的動(dòng)態(tài)分析。SPR不僅可以檢測(cè)出抗EDⅢ單抗與EDⅢ及E蛋白抗原動(dòng)態(tài)相互作用情況下的平衡解離常數(shù)（equilibrium dissociation constant，KD），而且可以得到EDⅢ單抗和抗原的結(jié)合常數(shù)（association

14、 constant，Ka）及解離常數(shù)(dissociationconstant，Kd)，以及表示抗體可及性(accessibility)的單抗活性百分?jǐn)?shù)。另外Ka及Kd值也為下一步抗原抗體共結(jié)晶提供了指導(dǎo)意義。結(jié)果顯示這2株單抗的親和力很高均達(dá)到了nM水平，且針對(duì)四個(gè)血清型EDⅢ抗原的親和力無明顯差異，結(jié)合中和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相互關(guān)系。更為重要的是，在膜融合抑制實(shí)驗(yàn)中，3E31顯示出了抑制融合作用，而2D73卻表現(xiàn)出了顯

15、著的膜融合增強(qiáng)作用，這一現(xiàn)象到目前為止從未被報(bào)道過。最后，我們對(duì)這2株交叉中和單抗的ADE活性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示它們顯示出了不同的ADE活性，單抗3E31不會(huì)引發(fā)針對(duì)四個(gè)血清型DENV的感染增強(qiáng)作用，而單抗2D73卻能夠在DENV2，DENV3及DENV4的感染后引發(fā)ADE作用?；谝陨系墓δ荑b定結(jié)果，我們推測(cè)單抗3E31及2D73的中和作用機(jī)制可能不同。
　　 第三部分：結(jié)晶學(xué)技術(shù)分析四型交叉抗DENV EDⅢ中和抗體的中和

16、作用機(jī)制。為了對(duì)單抗2D73及3E31的中和作用機(jī)制進(jìn)行更深入的探討，將抗體的Fab段與E蛋白Ⅲ區(qū)抗原進(jìn)行共結(jié)晶，獲取晶體后通過X-ray衍射后分別獲取了2組高分辨率的結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)，分辨率分別為2.2(A)及2.0(A)。通過軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行三維立體結(jié)構(gòu)學(xué)分析，最終確定該2株單抗結(jié)合的抗原表位。結(jié)果顯示這2株單抗識(shí)別了2個(gè)不同但稍有重疊的表位。單抗3E31的抗原表位主要集中于ABloop及E strand。其中形成氫鍵及鹽橋的氨基酸在DEN

17、V四個(gè)血清型中完全保守，這解釋了該單抗具備四型交叉中和能力。單抗2D73識(shí)別的表位主要集中于Astrand及G strand，這些氨基酸同樣在DENV四個(gè)血清型中高度保守。通過與目前已發(fā)表的其他相關(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，3E31識(shí)別的表位與單抗2H12相同，而2D73的表位則與單抗4E11、1A1D-2所識(shí)別的表位非常接近，人們把這類單抗稱為“A strand”單抗。隨后，通過對(duì)2D73表位及3E31表位在完整DENV顆粒表面的融合前E蛋

18、白二聚體表面暴露情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3E31表位完全隱藏于病毒顆粒內(nèi)部，而2D73表位僅有極小部分暴露在外。那么該2株抗體是如何結(jié)合完整病毒并進(jìn)行中和作用的？而當(dāng)E蛋白二聚體經(jīng)過構(gòu)象變化轉(zhuǎn)變?yōu)槿垠w后，3E31表位仍然隱藏，2D73表位卻大部分暴露，該結(jié)果與功能研究中的膜融合抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果相呼應(yīng)。結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們最終對(duì)2株四型交叉中和單抗3E31及2D73的中和作用機(jī)制進(jìn)行了深入明了的闡述，并進(jìn)一步為抗DENV疫苗及治療性藥物的研發(fā)

19、提供了新的思路，同時(shí)也為理解ADE的發(fā)生機(jī)制提供了幫助。
　　 通過以上三部分的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究的具有以下三個(gè)創(chuàng)新之處，其中包括：⑴利用我們建立的DENV特異性NS1抗原捕獲ELISA，建立了一種新的基于傳統(tǒng)TCID50測(cè)定的TCID50-ELISA方法學(xué)，在6天時(shí)間內(nèi)對(duì)DENV1-4進(jìn)行精確的滴定。TCID50-ELISA方法不僅顯示出了與傳統(tǒng)的噬斑實(shí)驗(yàn)及TCID50結(jié)果的一致性，還具備較好的重復(fù)性。原因在于我們通過檢測(cè)N

20、S1蛋白替代CPE的觀察，從而排除了不同操作者及實(shí)驗(yàn)室?guī)淼闹饔^差異。另外，TCID50-ELISA方法還克服了傳統(tǒng)的噬斑實(shí)驗(yàn)及TCID50-CPE方法學(xué)的缺點(diǎn)，能夠同時(shí)運(yùn)用于C6/36，Vero E6，BHK-21及Vero cells等不同的敏感細(xì)胞株，且不受細(xì)胞株?duì)顟B(tài)的影響。另外，TCID50-ELISA方法亦能夠?qū)εR床分離株進(jìn)行精確的滴定。基于很好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，TCID50-ELISA可以替代傳統(tǒng)的方法對(duì)DENV進(jìn)行滴定，對(duì)

21、登革熱的研究起到了促進(jìn)作用。⑵在本研究中，我們通過一些功能實(shí)驗(yàn)對(duì)2株抗EDⅢ交叉反應(yīng)中和抗體3E31及2D73進(jìn)行了鑒定。2株單抗均能中和DENV四個(gè)血清型的感染，且單抗與DENV結(jié)合的親和力及中和能力呈溫度依賴性。這兩株單抗在膜融合抑制實(shí)驗(yàn)及ADE實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出了不同的作用，提示二者的中和作用機(jī)制可能并不相同。本研究發(fā)現(xiàn)抗病毒中和抗體2D73能夠在病毒與細(xì)胞膜融合過程中起到增強(qiáng)作用，據(jù)我們所知，過去并未出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。這一新發(fā)現(xiàn)為后續(xù)人

22、們對(duì)抗病毒中和抗體的功能研究提供了新思路。另外，研究發(fā)現(xiàn)中和單抗3E31不具備ADE活性，提示此抗體具備成為免疫治療性抗體的潛在可能性。⑶為了對(duì)中和單抗3E31及2D73的中和作用機(jī)制的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，本研究中，我們通過結(jié)晶學(xué)技術(shù)將單抗的Fab段與EDⅢ蛋白進(jìn)行抗原抗體的共結(jié)晶。通過X-ray對(duì)晶體進(jìn)行衍射后，收集高分辨率的數(shù)據(jù)進(jìn)行三維立體晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)分析。根據(jù)最終解析的抗原抗體結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，我們對(duì)單抗3E31和2D73所識(shí)別的