登革Ⅱ型病毒E蛋白第一、二結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、鑒定及蚊蟲組織中登革病毒受體分子的研究.pdf

1、登革病毒(DENV)是最常見的地理分布最廣的，通過節(jié)肢動物（伊蚊）傳播的蟲媒病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，分布于全球100多個國家，特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)。近十年來，登革熱在全世界的發(fā)病率提高了近30倍。世界衛(wèi)生組織估算，全球每年登革病毒感染數(shù)目約為5千萬到1億人，而且兩種以上血清型病毒的共循環(huán)，以及敏感人群的不斷出現(xiàn)，不但導(dǎo)致登革熱流行頻率加快，也使登革病毒繼發(fā)感染引起的病死率很高的登革出血熱/登革休克綜合征病例大量出現(xiàn)。目前全球大約有

2、25億人受登革病毒感染的威脅，每年大約有5000萬人感染登革熱，其中大約有210萬的嚴(yán)重病例，50萬例登革出血熱，20000例死亡病例。登革病毒感染引起的病變范圍很廣，從自限性疾病到嚴(yán)重危及生命的登革熱、登革出血熱以及登革休克綜合征。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化程度的加快和氣候的持續(xù)變暖、加上蚊媒的擴(kuò)散速度加快、分布范圍變廣，登革熱/登革出血熱已成為熱帶、亞熱帶地區(qū)最為重要的蚊-傳播毒性疾病，是重要的公共衛(wèi)生問題。
　　 登革病毒是一個正

3、義單鏈RNA病毒，包括四種血清型(DENV1-4)。登革病毒基因組RNA編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白衣殼蛋白、包膜糖蛋白、膜蛋白及其前體(C、E、prM/M)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)。包膜糖蛋白E是主要的病毒顆粒包膜糖蛋白，是由494～501氨基酸殘基組成的、分子質(zhì)量約為55～60KDa的糖蛋白，其編碼序列在蟲媒病毒中的同源性較高（約為40％）且蛋白中所有Cys殘基均高度保守，黃病毒屬各成員

4、E蛋白之間具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。登革病毒以同源三聚體形式存在于成熟病毒顆粒表面。結(jié)晶學(xué)的研究表明，登革病毒的包膜糖蛋白E，分為3個結(jié)構(gòu)域(Ⅰ-Ⅲ)。在三個結(jié)構(gòu)中，β鏈形成的二級結(jié)構(gòu)是其主要結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域Ⅰ位于E蛋白單體中央，E蛋白Ⅱ區(qū)折疊成長的指樣結(jié)構(gòu)，E蛋白C端的氨基酸殘基構(gòu)成了結(jié)構(gòu)域Ⅲ。因?yàn)樵谒谐墒炀哂懈腥拘缘狞S病毒中E蛋白均是由與病毒融合有關(guān)的同源二聚體形成，推斷E蛋白的所有結(jié)構(gòu)都可能和病毒與細(xì)胞的融合過程有關(guān)。其中E蛋白Ⅱ區(qū)中第

5、98～111位氨基酸殘基組成的cd環(huán)，富含甘氨酸且具有很強(qiáng)的疏水性，序列組成在幾乎所有的蟲媒黃病毒中高度保守。最近研究發(fā)現(xiàn)，cd環(huán)可在E蛋白由二聚體向三聚體的轉(zhuǎn)變過程中插入胞膜，參與病毒與宿主細(xì)胞膜的融合，被認(rèn)為是病毒融合靶點(diǎn)，或認(rèn)為是潛在的病毒融合肽。推斷第一、第二結(jié)構(gòu)域可能與登革病毒發(fā)病機(jī)制相關(guān)。
　　 病毒受體可以定義為位于宿主細(xì)胞表面能夠被病毒吸附蛋白（virusattachmentprotein，VAP）識別并與之結(jié)合

6、，從而引起病毒感染的分子復(fù)合物，其化學(xué)本質(zhì)是糖蛋白、蛋白聚糖、脂類或糖脂，大多屬于蛋白質(zhì)。病毒對細(xì)胞的感染過程實(shí)質(zhì)上就是病毒與宿主細(xì)胞作用的過程，病毒與細(xì)胞表面受體的結(jié)合是發(fā)生病毒感染的前提條件。這種結(jié)合作用客觀上反映了病毒結(jié)構(gòu)蛋白與受體空間構(gòu)象上的對應(yīng)關(guān)系。在登革病毒的初次感染過程中，位于病毒顆粒表面的結(jié)構(gòu)蛋白與細(xì)胞表面上的受體結(jié)合，并通過膜整合或內(nèi)吞作用細(xì)胞，進(jìn)而啟動一系列生物學(xué)事件。而在登革病毒的二次感染過程，登革病毒還可與體內(nèi)業(yè)

7、已存在的病毒特異性非中和抗體(如IgG)形成免疫復(fù)合物，并通過細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，這種抗體依賴性感染增強(qiáng)(antibody-dependentenhancement,ADE)作用可能與登革出血熱，登革休克綜合征的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。病毒與細(xì)胞受體的特異結(jié)合是病毒在長期進(jìn)化中與宿主相互作用的結(jié)果。病毒為了獲得更多的感染機(jī)會，通常能夠根據(jù)入侵途徑和靶細(xì)胞的不同，通過進(jìn)化獲得識別多種細(xì)胞受體的能力，最大限度地滿足自身增殖的需要。目前認(rèn)為，

8、病毒與受體的結(jié)合是一個多步驟過程，涉及不同的病毒吸附蛋白及多個靶細(xì)胞受體，細(xì)胞表面的結(jié)合分子可以是特異性的，也可以是非特異性的，病毒可能與一個以上的細(xì)胞表面分子結(jié)合，且同一病毒與不同細(xì)胞所結(jié)合的受體可能不同。目前實(shí)驗(yàn)室鑒定的潛在的登革病毒受體不下十幾種。作為典型的蚊媒病毒，登革病毒既能在蚊蟲細(xì)胞中有效復(fù)制，也能感染人體并導(dǎo)致發(fā)病，其在蚊蟲細(xì)胞中致病機(jī)理的研究歷來受到重視。隨著受體研究的逐步深入，蚊傳黃病毒的致病機(jī)制有望得以最終闡明，將在

9、選擇抗病毒藥物靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)新型疫苗中發(fā)揮不可估量的作用。
　　 目的:
　　 1.在大腸桿菌中表達(dá)登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第一、二結(jié)構(gòu)域(DⅠ，DⅡ)，并對其進(jìn)行免疫反應(yīng)性鑒定;
　　 2.哺乳動物BHK-21細(xì)胞連接登革Ⅱ型病毒受體分子，并對其進(jìn)行功能研究;
　　 3.不同期白蚊伊蚊總蛋白的提取及潛在受體的篩選。
　　 方法:
　　 1.登革Ⅱ型病毒接種乳鼠，提取總RNA;
　

10、　 2.并設(shè)計(jì)一對特異性引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增目的片段;
　　 3.以DV2-E-D1&2載體為模板，PCR擴(kuò)增E蛋白D1&2基因片斷并純化;
　　 4.雙酶切PCR純化產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-DV2-E-D1&2;
　　 5.篩選陽性菌落，并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞;
　　 6.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，并進(jìn)行Western

11、blot鑒定重組蛋白免疫反應(yīng)性;
　　 7.哺乳類動物細(xì)胞BHK-21的培養(yǎng);
　　 8.登革病毒的擴(kuò)大培養(yǎng)與純化;
　　 9.RT-PCR法及間接免疫熒光法(IFA)檢測細(xì)胞感染登革病毒;
　　 10.VOPBA（Virusoverlayproteinblotbindingassay）病毒覆蓋蛋白結(jié)合試驗(yàn)）方法篩選BHK-21細(xì)胞連接登革Ⅱ型病毒的受體分子;.
　　 11.白蚊伊蚊的飼養(yǎng);

12、>　　 12.不同期白蚊伊蚊總蛋白的提取及潛在受體的篩選。
　　 結(jié)果:
　　 1.提取乳鼠總RNA，RT-PCR擴(kuò)增得到約900bp的E蛋白第一、二結(jié)構(gòu)域基因片段;
　　 2.重組質(zhì)粒pET28a-DV2-E-D1&2經(jīng)Xho1和Nde1雙酶切后，可見約900bp大小的酶切片段;
　　 3.重組菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-DV2-E-D1&2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在37KDa位置有明顯的誘導(dǎo)

13、后表達(dá)帶，其大小與預(yù)測值一致。超聲裂解重組菌后，分別取上清與沉淀經(jīng)12％SDS-PAGE分析，顯示重組蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中;
　　 4.Westernblot結(jié)果顯示，重組菌誘導(dǎo)前的全菌蛋白沒有與His·Tag單抗及登革病毒單抗(D1-11)反應(yīng)的條帶，而誘導(dǎo)后的全菌蛋白和在相對分子質(zhì)量為37000的位置均有與His·Tag單抗反應(yīng)的特異條帶;
　　 5.與重組誘導(dǎo)前的全菌蛋白無反應(yīng)，只在誘導(dǎo)后的全菌蛋白中有

14、特異的條帶出現(xiàn)，且與預(yù)測的相對分子質(zhì)量為37000的位置相符合;
　　 6.BHK-21細(xì)胞蛋白病毒孵育組在30KDa及60KDa的位置有特異性的條帶出現(xiàn)，而陰性對照組無此條帶;
　　 7.在白紋伊蚊幼蟲、蛹和雌蚊中得到約35KDa大小的條帶，而雄蚊無這一分子，提示白紋伊蚊35kDa的DENV連接分子呈現(xiàn)登革病毒組織向性，推測其具有特異性。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功地在大腸桿菌中表達(dá)登革Ⅱ型病毒包膜糖