廣州地區(qū)登革病毒1型分子進(jìn)化的研究.pdf

1、目的：了解廣州地區(qū)不同流行年代登革病毒1型的分子流行病學(xué)特征、追蹤傳播來源；探討我國廣州地區(qū)登革病毒流行是否本地化，同時為登革疫苗研究篩選候選疫苗毒株提供一個重要依據(jù)。 方法： 依據(jù)廣州地區(qū)登革病毒1型的流行規(guī)模，選取流行規(guī)模最大的GZ01/95、其次GZ01/02，流行規(guī)模最小的GZ01/04及2006年新出現(xiàn)的毒株GZ17/06進(jìn)行研究，利用Primer5.0軟件參考登革病毒l型的標(biāo)準(zhǔn)株SIN/275/90設(shè)計引物，

2、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增GZ01/02、GZ01/04、GZ17/06流行株的E和NS1全基因，利用RT-PCR和RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)技術(shù)對GZ01/95株全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的目的基因分別克隆到pGEM-Teasy載體并轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PER和酶切鑒定陽性后進(jìn)行序列測定。對測序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行拼接，利用DNAStar軟件包中的Protean

3、程序分別進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測。Blast比對選取同源性較高的毒株及基因型的代表株，用C1ustalx1.83軟件進(jìn)行多重比對，應(yīng)用MEGA3.0軟件中的N-J、ME、MP和UPGMA四種方法進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。重組分析、計算遺傳距離、同意義性突變率和非同意義性突變率，并以6﹪的核苷酸差異(divergence)作為基因分型的標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 1. 四株登革病毒1型(DEN-1)GZ01/95、GZ01/02、GZ01/04和

4、GZ17/06株E基因序列全長均為1485bp，編碼495個氨基酸；核苷酸序列同源性在91﹪-98.4﹪之間，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在96﹪-99.2﹪之間。進(jìn)化分析顯示GZ01/95、GZ01/02、GZ01/04株屬于基因Ⅳ型或南太平洋型，而GZ17/06株屬于基因Ⅰ型或亞洲型。E蛋白毒力位點分析發(fā)現(xiàn)：四株DEN-1的E蛋白的兩個糖基化位點均沒有缺失，在E44(E)和E156(T)毒力位點四株病毒均沒有改變，在E366(N)→(S)

5、和E蛋白Ⅲ區(qū)毒力位點分析僅GZ01/95株的氨基酸發(fā)生了改變。 2. 四株DEN-1的NS1基因全長均為1056bp、編碼352個氨基酸，核苷酸序列同源性在91﹪-97.2﹪之間，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在97﹪-99﹪之間。進(jìn)化分析顯示：GZ01/95和IGZ01/02株仍屬于基因Ⅳ型(即南太平洋型)，GZ17/06株也和E基因的分析一樣屬于基因Ⅰ型(即亞洲型)，而GZ01/04株卻和E基因的分析不同而屬于基因Ⅰ型。NS1蛋白毒

6、力位點分析顯示：四株DEN-1在NS1-130和NS1-207兩個糖基化位點都沒有缺失，僅GZ01/95株在B細(xì)胞表位NS1-111-116區(qū)NS1-103發(fā)生了改變(T)→(M)。 3. 利用E/NS1(連接區(qū)240bp)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹顯示：GZ01/95、GZ01/02和GZ17/06株基因分型結(jié)果同E和NS1基因的進(jìn)化分析，GZ01/95株屬于基因Ⅳ型或南太平洋型(SP-1)和1995年以前印度尼西亞Indo88株同源

7、性最高，推斷1995年廣州地區(qū)登革病毒1型的流行可能是印度尼西亞毒株的輸入；GZ01/02株和澳大利亞1983、2000年流行的毒株遺傳距離最近，并且也屬于基因Ⅳ型或南太平洋型(SP-2)，所以2002年廣州地區(qū)登革病毒1型的流行很可能和澳大利亞流行株有關(guān)；GZ17/06株都屬于基因Ⅰ型或亞洲型，和ZJ/04、泰國2001、泰國2002年流行的毒株都在同一個分枝上且和泰國流行的Thai01、Thai02株同源性均最高，提示廣州地區(qū)200

8、6年流行的登革病毒1型可能來自泰國毒株的輸入。 4. GZ01/04株的E/NS1(連接區(qū)240bp)和NS1基因的分析一致屬于基因I型，重組分析發(fā)現(xiàn)GZ01/04株是進(jìn)化過程中來自兩個不同世系的重組株，一個世系來自廣州地區(qū)分離株GZ01/02株屬于基因Ⅳ型，另一個世系是我國福建2004年分離株Fj234/04屬于基因Ⅰ型。 5. GZ01/95株全基因組序列全長10735bp，95-10271為ORF區(qū)編碼3392個氨

9、基酸。編碼區(qū)(CDS)的進(jìn)化分析顯示：1995年廣州地區(qū)流行的毒株仍屬于基因Ⅳ型和1995年以前印度尼西亞Indo88株同源性最高97.5﹪，和E、NS1、E/NS1基因分析的結(jié)果一致；和GZ01/95株同在一個進(jìn)化分支上的還有印度洋國家塞舌爾2003年和2004年、大洋洲國家密克羅尼西亞2004年及南非地區(qū)留尼旺島2004年流行的登革病毒1型毒株，并且同源性在96﹪-97.8﹪之間，提示廣州地區(qū)1995年流行的毒株一直在東南亞、大洋洲

10、、印度洋和南非地區(qū)流行。5`UTR(DOD-coding regions)區(qū)有94個核苷酸，GZ01/95株和同源性最高的Ind088株比較僅有一個核苷酸的差異，在26位上GZ01/95株(A)一(G)，導(dǎo)致GZ01/95株二級結(jié)構(gòu)在第20-30位這段堿基序列形成了2個小環(huán)。3`UTR區(qū)有462個核苷酸，GZ01/95株和Iado88株有13個核苷酸的差異，突變多發(fā)生在NS5終止密碼子之后的高變區(qū)(HBV)，均有保守的RCS2、CS2結(jié)

11、構(gòu)，3`末端形成長發(fā)夾結(jié)構(gòu)(3`LSH)，但GZ01/95株在3`LSH的莖上凸出一個環(huán)。毒力位點分析顯示GZ01/95株在E、NS1、NS5、3`UTR的毒力位點都發(fā)生了變異。 結(jié)論： 本論文對登革病毒1型的進(jìn)化分析表明：廣州地區(qū)不同年份流行的登革病毒1型的基因分型不同，廣州地區(qū)登革病毒的流行沒有地域性的限制，并且不同年代流行的毒株核酸有較大的差異，與各毒株同源性最高的毒株均為國外不同的流行株，因此推斷廣州地區(qū)1995

12、、2002、2004和2006年流行的登革病毒1型可能來自境外不同的疫源地。近十多年來廣州地區(qū)幾乎每年都有登革病毒的流行且大部分是DEN-1，本論文的進(jìn)化分析仍沒有發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)成為登革病毒疫源地的可靠證據(jù)。GZ01/95株的CDS區(qū)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該世系的毒株一直在東南亞、大洋洲、印度洋和南非地區(qū)流行，毒力位點分析顯示1995年流行株在E、NS1、NS5、3`UTR的位點都可能發(fā)生了毒力變異，因此GZ01/95株在登革病毒1型中有著重要的代