登革2型病毒非結構蛋白NS2B的表達、純化及其抗體制備.pdf

1、登革病毒(dengueviruses，DV)屬于黃病毒屬(Flavivirus)，根據(jù)E蛋白的抗原性不同，可分4種血清型(DV21-4)。它由主要由埃及伊蚊傳播，引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合癥。全世界大約有40％的人居住在熱帶和亞熱帶地區(qū)，屬于感染的高危人群。每年全世界大約有1億人感染登革出血熱，死亡率約為5％。到目前為止，尚無安全有效的疫苗進行預防和特效抗DV藥物進行治療?？梢奃V感染已是嚴重的公共衛(wèi)生問題。 DV2

2、是有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約11KD，編碼一個多肽鏈后，在宿主的信號肽酶和病毒編碼的蛋白酶作用下裂解為三種結構蛋白(C、prM、E)和七種非結構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)。在黃病毒屬蛋白酶作用其自身編碼的多聚蛋白底物的過程中，需要活化蛋白或者輔助因子使蛋白酶的達到最佳活性，目前認為NS2B即是一個重要的輔助因子，在激活NS3蛋白酶和NS2B-NS3異二聚體中發(fā)揮作用，因而成為研究

3、者關注的靶點。 NS2B是亞細胞定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個膜內(nèi)蛋白。在相對區(qū)分NS2B疏水性區(qū)域的基礎上分為七個區(qū)域(Ⅰ一Ⅶ)，其中，Ⅳ(G69-E80)為疏水的核心區(qū)，能夠直接與NS3蛋白酶結合。其側面的兩個親水性區(qū)域(Ⅲ-Ⅴ)，用突變的質(zhì)粒轉染到細胞內(nèi)顯示NS2B的40個氨基酸圍繞在Ⅲ到Ⅴ區(qū)，是最佳刺激NS3蛋白酶的活性區(qū)域。而且，通過免疫共沉淀實驗證明，NS2B-NS3蛋白酶的活性也是由這個親水性片段介導的。目前，正在從分子學

4、結構證明NS2B輔助因子激活蛋白酶的活性機制。NS2B除了激活蛋白酶的活性外，還能促進NS3與膜的融合，是NS3誘導細胞發(fā)生凋亡的重要輔助因子。 NS2B在病毒復制過程中的作用目前尚不十分清楚，重要原因之一是缺乏特異性的顯示手段，為進一步研究NS2B蛋白在DV2感染過程中的作用和作為新檢測靶抗原的可能性，本課題構建NS2B蛋白的原核和真核表達載體，經(jīng)過克隆、表達和純化，制備了抗NS2B的多克隆抗體，為下一步研究工作提供了免疫學

5、工具。 本研究主要結果與結論如下： 一.DV2NS2B蛋白的原核表達、抗血清的制備及其生物學特性的初探 1.NS2B的原核表達、抗血清的制備 利用RT-PCR以DV2mRNA為模板擴增出DV2NS2B編碼基因NS2B。將NS2B全長基因插入原核表達載體pQE31，轉化大腸桿菌JM109，獲得的pQE-NS2B/JM109工程菌經(jīng)IPTG誘導后，超聲裂解提取表達產(chǎn)物，融合蛋白NS2B以包涵體的形式存

6、在。包涵體裂解液經(jīng)Ni-NTA親和純化后，獲得大小相符的特異目標蛋白條帶。經(jīng)Westernblot證實為所需目的蛋白。目的蛋白經(jīng)純化復性后免疫BALB/c小鼠，獲得了抗體效價較高的抗血清，經(jīng)ELISA檢測，鼠抗血清效價達到了1:12800。利用Westernblot和間接免疫熒光證實，抗血清能特異性地識別DV2NS2B蛋白。NS2B抗血清的成功制備為進一步研究NS2B在DV2感染機制中的作用提供良好的工具。 2.DV2NS2B

7、多克隆抗體的生物學功能 通過PRNT檢測，DV2NS2B產(chǎn)生的抗血清中和病毒的作用不明顯，可能不具有免疫保護作用；收集DV2感染后不同時間點的ECV304細胞，免疫熒光檢測顯示：感染12h后用NS2B抗血清能檢測到NS2B抗原，隨著感染時間的延長，NS2B蛋白在細胞內(nèi)的含量也隨著增加；激光共聚焦顯示：NS2B蛋白與NS3蛋自在感染12h、24h和48h后的ECV304細胞核周和胞質(zhì)中有共存區(qū)域。 二、DVNS2B蛋白

8、在真核表達載體的克隆、表達及其DNA免疫 1.真核表達質(zhì)粒pCAGGS-P7/NS2B的構建 通過PCR擴增出DV2NS2B編碼基因。將NS2B全長基因插入真核表達載體pCAGGS，轉化大腸桿菌XL-Blue，獲得pCAGGS-P7/NS2BXL-Blue工程菌。超純提取質(zhì)粒pCAGGS-P7/NS2BDNA后，利用脂質(zhì)體法瞬時轉染細胞Vero，間接免疫熒光染色顯示NS2B蛋白的表達，該質(zhì)粒命名為：pCAGGS-P7

9、/NS2B。 2.pCAGGS-P7/NS2B質(zhì)粒DNA免疫BALB/c小鼠 經(jīng)大規(guī)模超純提取質(zhì)粒pCAGGS-P7/NS2BDNA后，注射到BALB/c小鼠后，經(jīng)ELISA檢測，鼠抗血清效價達到了1:2000，利用Westernblot和間接免疫熒光證實，DNA免疫產(chǎn)生的NS2B抗血清能特異性地識別DV2NS2B蛋白。 本研究分別用原核表達載體和真核表達載構建的NS2B重組質(zhì)粒，分別以蛋白免疫和DNA免疫