流行性乙型腦炎病毒E蛋白及其結(jié)構(gòu)域Ⅲ的原核表達(dá)及酵母雙雜交系統(tǒng)的初步構(gòu)建.pdf

1、流行性乙型腦炎簡(jiǎn)稱乙腦，是由乙腦病毒（也稱日本腦炎病毒，Japaneseencephalitis virus，JEV）引起、由蚊蟲(chóng)傳播的一種急性病毒性傳染病，主要侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)人類健康威脅很大。WHO估計(jì)，目前乙腦每年發(fā)病約50000例，其中約1/3的病例死亡，且乙腦后遺癥嚴(yán)重，存活者20％~40％留有神經(jīng)麻痹和心理改變等嚴(yán)重后遺癥，給家庭和社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。近幾年我國(guó)乙腦報(bào)告病例數(shù)每年在5000～10000例之間，

2、病死率約5％-35％，且有15％的幸存者可發(fā)生嚴(yán)重的神經(jīng)精神后遺癥。盡管目前對(duì)JEV的分子生物學(xué)、免疫學(xué)特性的研究和乙腦的臨床救治等取得了很大的進(jìn)展，疫苗的應(yīng)用也使乙腦的發(fā)病率有所下降，但是關(guān)于JEV感染的分子機(jī)制還不完全清楚。 病毒受體決定了病毒的宿主范圍、組織及細(xì)胞親嗜性，并影響其致病性。 一般認(rèn)為JEV囊膜糖蛋白E是該病毒的受體結(jié)合蛋白（VAP），能夠介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的膜融合。研究發(fā)現(xiàn)E蛋白抗原決定簇分為三個(gè)區(qū)，即結(jié)

3、構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ。其中結(jié)構(gòu)域Ⅱ被認(rèn)為具有中和與血凝活性的表位，而結(jié)構(gòu)域Ⅲ是受體的主要結(jié)合部位，能夠介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的膜融合。 本研究利用大腸埃希菌表達(dá)了JEV的E蛋白和E蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅲ，還構(gòu)建了以JEV的E蛋白為誘餌蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究JEV E蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特別是與其受體蛋白的相互作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 1．JEV E 蛋白的原核表達(dá)及其鑒定 從JEV感染乳鼠腦中提取總RNA，采用特異性引

4、物擴(kuò)增出JEV E蛋白基因。將E基因克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)酶切鑒定和序列測(cè)定無(wú)誤后，再將該基因克隆到表達(dá)載體pET28a中，并轉(zhuǎn)化E. Coli后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明，在相對(duì)分子質(zhì)量約53kDa處有明顯的條帶，與預(yù)期的6His-E融和蛋白大小一致；表達(dá)蛋白主要以包涵體形體存在于沉淀中。薄層掃描顯示目的蛋白占菌體總蛋白的40％。采用Ni2+-NTA親和色譜柱進(jìn)行純化，獲得了純化的JEV E蛋白。Western

5、 blot分析結(jié)果表明，表達(dá)的JEV E蛋白較好地保持了與抗JEV mAb和多抗的結(jié)合活性。 2．JEV E 蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的原核表達(dá)及其鑒定 從JEV感染乳鼠腦中提取總RNA，采用特異性引物擴(kuò)增出JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因。將結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)酶切鑒定和序列測(cè)定無(wú)誤后，再將該基因克隆到表達(dá)載體pET32a中，并轉(zhuǎn)化E. Coli后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明，在相對(duì)分子質(zhì)量約20

6、kDa處有明顯的條帶，與預(yù)期的6His-E-Ⅲ融和蛋白大小一致；表達(dá)蛋白約50％以包涵體形體存在于沉淀中，50％以可溶性形式存在于上清中。薄層掃描顯示目的蛋白占菌體總蛋白的40％。采用Ni2+-NTA親和色譜柱進(jìn)行純化，獲得了純化的JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ蛋白。采用抗his mAb進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明，表達(dá)的該融合蛋白較好地保持了與抗體的結(jié)合活性。3．JEV E 蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達(dá)及其對(duì)報(bào)告基因激活作用的檢

7、測(cè)將JEV E 蛋白基因片段克隆入載體pUC19 中，經(jīng)酶切鑒定和序列測(cè)定無(wú)誤后，再將該基因克隆到表達(dá)載體pGBKT7 中，并轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109，獲得了以JEV E 為誘餌蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng)。檢測(cè)該系統(tǒng)中JEV E 對(duì)酵母細(xì)胞有無(wú)毒性作用及對(duì)報(bào)告基因有無(wú)激活作用。 結(jié)果 帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的AH109 酵母菌在His 營(yíng)養(yǎng)缺陷的SD 培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，表明構(gòu)建的JEV E蛋白對(duì)His3 基因無(wú)激活作用；β-半乳糖苷酶印