流行性乙型腦炎病毒E蛋白主要抗原域與豬IgG-,1--Fc片段在大腸桿菌中的融合表達(dá)及其應(yīng)用研究.pdf

1、流行性乙型腦炎(Epidemic Encephalitis B)是由日本腦炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus，JEV)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性傳染病。本病不但對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且在世界許多國(guó)家廣泛存在，嚴(yán)重威脅著人類的健康。乙腦的診斷可以通過(guò)臨床檢測(cè)結(jié)合流行病學(xué)進(jìn)行，確診需要實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)。目前，乙腦的治療沒(méi)有有效的方法，只有進(jìn)行疫苗接種結(jié)合滅蚊工作進(jìn)行。 本文利甩E.coli

2、原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)JEV主要結(jié)構(gòu)基因E蛋白基因和豬IgG<,1>-Fc片段基因在大腸桿菌中進(jìn)行了融合表達(dá)，并利用表達(dá)產(chǎn)物初步建立了檢測(cè)JEV抗體的新型SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)，同時(shí)免疫BALB／c小鼠，評(píng)價(jià)融合蛋白E-pFc誘導(dǎo)BALB／e小鼠產(chǎn)生抗JEV特異性免疫效果。這為新型流行性乙型腦炎的血清診斷方法的建立和新型疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下： 1．根據(jù)GenBank公布的豬IgGl的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，克隆豬IgG<,1

3、>-Fc域中包含部分CH2和完整CH3片段的基因。測(cè)序結(jié)果表明，RT-PCR產(chǎn)物大小為469bp，該片段的核苷酸序列與GenBank收錄的豬IgG<,1>的核苷酸序列同源性為99.2％，與豬IgG<,2>、IgG<,2>b、IgG<,3>、IgG<,4>核苷酸序列同源性分別為89.7％、89.7％、96.7％以及91.4％。從遺傳進(jìn)化樹(shù)中可以看出，擴(kuò)增片段與豬IgG<,1>的遺傳距離最近，在同一分支上。這說(shuō)明我擴(kuò)增的序列是豬IgG<,1

4、>亞型的。 2．該片段編碼的氨基酸序列的長(zhǎng)度為120，與豬源IgG氨基酸序列同源性較高，為79.2％～98.3％，與其它動(dòng)物IgG氨基酸序列同源性低于68.3％。從推導(dǎo)的氨基酸序列可以看出，該片段中含有兩個(gè)半胱氨酸Cys38和Cys98，這與設(shè)計(jì)一致。 3．通過(guò)Linker連接到表達(dá)載體pET-E中E基因的下游，即構(gòu)建成了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-E-pFc，用酶切鑒定插入目的基因的正確性。將其轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)

5、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和超聲波裂解菌體后，運(yùn)用SDS-PAGE進(jìn)行可溶性分析，然后以His·Bind螯合層析柱和SPA親和層析柱兩種方法純化融合蛋白，SDS-PAGE、薄層凝膠掃描、Western Blotting和iELISA對(duì)該融合蛋白進(jìn)行了鑒定，并分析了兩種親和層析方法的純化效果。結(jié)果顯示，重組融合蛋白以包涵體的形式獲得了高效表達(dá)，其表達(dá)量達(dá)27.5％，上述兩種層析方法純化的融合蛋白E.pFc達(dá)到了較高的純度，其純度達(dá)96％，且證實(shí)了重

6、組融合蛋白具有良好的抗原性和與SPA結(jié)合的特性，但變性的融合蛋白失去了與SPA結(jié)合的能力。 4.以純化的重組融合蛋白E-pFc致敏SPA穩(wěn)定液制成凝集抗原，成功地建立了一種檢測(cè)JEV抗體的新型SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)。通過(guò)對(duì)其非特異因素的消除、致敏條件和工作條件的優(yōu)化以及自凝性、特異性、重復(fù)性和保存期試驗(yàn)，我們建立了檢測(cè)JEV抗體的新型SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)。用建立的SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)方法與間接血凝試驗(yàn)和乳膠凝集試驗(yàn)同時(shí)對(duì)102份豬血清樣品進(jìn)行

7、檢測(cè)結(jié)果顯示：HI檢測(cè)陽(yáng)性率為61.8％，SPA-CoA陽(yáng)性率為64.7％；二者陽(yáng)性符合率83.3％，總符合率為81.4％，SPA-CoA檢出陽(yáng)性率較HI高2.9％，二者差異不顯著(P>0.05)。 5.評(píng)價(jià)融合蛋白E.pFc對(duì)BALB/c小鼠特異性細(xì)胞免疫和體液免疫的影響。以100pmol的E蛋白和融合蛋白E-Fc采用腹膜內(nèi)注射方法免疫BALB/c小鼠，用定量ELISA測(cè)定細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的水平，MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)