抗乙型腦炎病母E蛋白多克隆抗體的制備及寵物犬感染乙腦病毒血清中和抗體的動態(tài)變化研究.pdf

1、日本腦炎(JE)是一種廣泛流行于亞洲和環(huán)太平洋地區(qū)的人獸共患傳染病，它影響著人類的健康并危害著畜牧業(yè)，特別是養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。其病原體日本腦炎病毒(JEV)是一種典型的蟲媒病毒，蚊子在該病毒的傳播過程中發(fā)揮著重要的作用?，F(xiàn)已報道自然界中有60多種動物可感染JEV，其中多數(shù)物種感染病毒后沒有明顯的臨床癥狀，只能檢測到動物血清高水平的中和抗體。
　　 1.JEV EDⅢ結(jié)構(gòu)域蛋白的原核表達(dá)、多克隆抗體的制備與鑒定
　　 JEV表

2、面的囊膜蛋白（E蛋白）是該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，該蛋白主要由3個結(jié)構(gòu)域組成，其中結(jié)構(gòu)域Ⅲ(E蛋白第312～411位氨基酸殘基)獨立地在病毒表面折疊成為免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)，為誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的重要區(qū)域。實驗中采用原核表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)pET-32a-EⅢ蛋白，經(jīng)過Ni+柱純化后多次免疫新西蘭大白兔，制備兔抗JEV E蛋白多克隆抗體。間接ELISA結(jié)果表明，以原核表達(dá)的重組蛋白為抗原，檢測該多克隆抗體血清的效價為1∶256000; Weste

3、rn-blot試驗中，1∶1000倍稀釋的多抗血清與1μg的重組蛋白反應(yīng)，能夠顯示出明顯的條帶，與經(jīng)過濃縮的JEV全病毒抗原反應(yīng)顯出一條分子量大小約為53KD（E蛋白）的目的條帶;間接免疫熒光試驗中，多克隆抗體與BHK-21細(xì)胞內(nèi)的JEV反應(yīng)，最后在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生綠色免疫熒光，對照組無特異性熒光;空斑減少中和試驗中，多抗血清的中和抗體效價為1∶160。表明制備的多克隆抗體與重組蛋白和JEV E蛋白都能發(fā)生良好反應(yīng)，并且該多抗有較高水平的中

4、和效價。
　　 2.寵物犬感染JEV體內(nèi)中和抗體動態(tài)變化研究
　　 犬感染JEV，能檢測到高陽性率和體內(nèi)高水平的中和抗體在國外已有報道。寵物犬與人關(guān)系密切，將其作為哨兵動物來監(jiān)測當(dāng)?shù)厝耸艿絁EV感染的風(fēng)險性具有重要價值和意義。實驗在上海某寵物醫(yī)院采集了1年內(nèi)各個月份不同年齡27個品種的寵物犬血液共253份，監(jiān)測了在自然感染條件下其體內(nèi)JEV中和抗體隨流行季節(jié)的變化規(guī)律?？傮w中和抗體陽性率達(dá)到28.1％。不同季節(jié)間犬JE中

5、和抗體水平差異顯著，JEV流行季節(jié)（6-9月）之前和之后的三個月中和抗體陽性率分別為16.3％和43.4％，差異極顯著(x2=14.432，p＜0.01)。犬的年齡間（小于一歲與大于1歲）中和抗體陽性率為24.1％和39.0％，差異顯著(x2=5.633，p＜0.05)。而犬的性別間中和抗體陽性率無顯著差異(x2=1.860，p＞0.05)。結(jié)果表明寵物犬在JE流行季節(jié)、自然感染條件下受到JEV感染的機(jī)率較高。
　　 通過人工感