兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗體的制備及應用.pdf

1、細胞凋亡是一種由多種基因共同調控的自身編碼的死亡方式，確保了正常的胚胎發(fā)育和機體內環(huán)境的自身穩(wěn)定。在形態(tài)學上，DNA的片段化為細胞凋亡的特征性表現。DFF40（DNA fragmentation factor 40）是一種DNA酶，在DNA片段化過程中發(fā)揮著關鍵性的作用。CIDE（cell death-inducing DFF45-like effector）家族蛋白同DFF蛋白在多肽鏈的N端具有同源性，是細胞凋亡誘導因子中的一個新成員

2、，現在已知的CIDE蛋白中，人類有CIDE-A、CIDE-B和CIDE-3。其中人CIDE-3基因于2003年發(fā)現，其在GenBank中的登錄號為AC007783，位于人類3p25染色體上，全長約169 kb，人CIDE-3基因cDNA含有1305個堿基，存在選擇性剪切，具有誘導細胞凋亡的功能。但是，人CIDE-3基因在組織中的分布、其生理和病理功能以及與細胞凋亡的關系目前還不清楚。 為此本研究通過RT-PCR方法獲得人CIDE

3、-3的編碼區(qū)基因，構建原核表達載體，經測序和酶切鑒定后，轉化大腸桿菌進行體外表達，獲得了人CIDE-3原核表達蛋白。免疫新西蘭大白兔，制備出多克隆抗體，經鑒定后，應用免疫組織化學法初步了解了人CIDE-3蛋白在人類部分正常組織和部分腫瘤組織中的分布。 本文研究結果： 1. 構建了原核表達載體pET28a(+)-CIDE-3。經酶切鑒定和DNA 測序，目的基因片段的序列同GenBank中登錄的相應序列完全吻合。 2

4、. 在大腸桿菌中表達了人CIDE-3蛋白N端的172個氨基酸，由Ni-NTA Agarose (pH 8.0)純化。SDS-PAGE和Western blot證實獲得了純化的人CIDE-3蛋白。 3. 制備兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗體，ELISA結果顯示，該多克隆抗體效價高于1:30000，具有較高的親和性；Western blot結果顯示，該多克隆抗體可以與人CIDE-3蛋白特異性結合。免疫組織化學染色，結果顯示人CIDE

5、-3蛋白分布于部分胃粘膜上皮細胞的細胞質中，屬于細胞質蛋白；通過比較胃組織連續(xù)切片的免疫組織化學染色片和HE 染色片推測陽性細胞可能為胃粘膜壁細胞。 4. 人CIDE-3蛋白陽性表達于腎臟腎小管上皮細胞（5/5例）（腎皮質2例、腎髓質3例陽性染色）；食道粘膜鱗狀上皮細胞（5/5例）、心?。?/5例）、結腸粘膜上皮細胞（7/10例）、胰腺（3/5例）（胰島1例、胰腺外分泌腺體2例陽性染色）和肝（2/5例）。陽性物質均位于細胞胞質中

6、，呈棕黃色顆粒狀。腦（0/5例）和肺組織（0/5例）未見陽性細胞。 5. 人CIDE-3蛋白還存在于原發(fā)性肝細胞癌（hepatic cell carcinoma，HCC）（10/37例）、胃腺癌（4/19例）和乳腺癌（1/17例），HCC細胞中人CIDE-3蛋白的陽性表達率（10/37例）顯著低于癌旁肝細胞（28/29例）（P<0.05），其中各分化階段HCC細胞（高、中、低分化）中人CIDE-3蛋白的陽性表達率分別低于癌旁肝細