人CIDE-3基因在脂肪細(xì)胞分化及代謝中作用的研究.pdf

1、脂肪組織是機(jī)體能量?jī)?chǔ)存及利用的重要場(chǎng)所。脂肪細(xì)胞分化和代謝異?？蓪?dǎo)致肥胖發(fā)生，目前肥胖已日趨成為世界性的健康問題，同時(shí)肥胖也是糖尿病和心腦血管疾病等多種慢性疾病的危險(xiǎn)因素。因此研究其發(fā)病機(jī)理對(duì)于預(yù)防和治療肥胖及其相關(guān)疾病具有非常重要的意義。
　　CIDE（celldeath-inducingDFF45-likeeffector）家族是20世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的一組可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因。近來發(fā)現(xiàn)，其家族成員與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。其中Fsp27

2、（fatspecificprotein），小鼠脂肪特異蛋白，僅在成熟的脂肪細(xì)胞中表達(dá)。Fsp27定位于脂滴可以抑制脂肪分解促進(jìn)脂肪積聚。CIDE-3是Fsp27在人的同源物，其主要分布在小腸、心臟、結(jié)腸和胃，在腦、腎臟和肝中低表達(dá)，并不是脂肪特異基因。那么CIDE-3在人體內(nèi)生物學(xué)功能如何，是否也像FSP27一樣在脂肪細(xì)胞分化代謝過程中發(fā)揮重要作用，這些問題并不十分清楚。
　　在本研究中，我們構(gòu)建了EGFP-CIDE-3及DsRe

3、d1-CIDE-3融合基因真核表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞確定CIDE-3蛋白的亞細(xì)胞定位。并構(gòu)建攜帶EGFP-CIDE-3及DsRed1-CIDE-3融合基因的腺病毒，同時(shí)進(jìn)行了人前脂肪細(xì)胞的體外分離和原代培養(yǎng)，并通過腺病毒感染過表達(dá)CIDE-3以探討脂肪細(xì)胞的增殖分化機(jī)制和CIDE-3在脂肪細(xì)胞分化代謝過程中的作用。
　　【目的】
　　1、確定CIDE-3蛋白的亞細(xì)胞定位；2、構(gòu)建攜帶EGFP-CIDE-3及DsRe

4、d1-CIDE-3融合基因的腺病毒；3、研究CIDE-3在脂肪細(xì)胞分化代謝過程中的作用。
　　【方法】
　　1、構(gòu)建EGFP-CIDE-3及DsRed1-CIDE-3融合基因真核表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞以確定CIDE-3蛋白的亞細(xì)胞定位；2、利用Stratagene公司的AdEasyTMXL腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建攜帶EGFP-CIDE-3及DsRed1-CIDE-3融合基因的腺病毒；3、從抽脂獲得的脂肪乳液進(jìn)行人前

5、脂肪細(xì)胞的體外分離和原代培養(yǎng)；4、利用MTT方法繪制人前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；5、利用流式細(xì)胞方法測(cè)定前脂肪細(xì)胞的表面標(biāo)志分子以鑒定細(xì)胞的來源；6、通過腺病毒感染的方法過表達(dá)CIDE-3以探討CIDE-3在脂肪細(xì)胞分化代謝過程中的作用。
　　【結(jié)果】
　　1、CIDE-3蛋白主要定位于脂滴表面，部分位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上
　　首先以真核表達(dá)質(zhì)粒pShuttle-CMV作為載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-EGFP-CI

6、DE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3，然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行了酶切電泳及DNA測(cè)序等分析，證實(shí)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3。為了研究CIDE-3蛋白的亞細(xì)胞定位，我們以脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。采用GFP-CB5（CytochromeB5，已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位）作為ER標(biāo)志物；GFP-ADRP作為脂滴的標(biāo)

7、志物；Bodipy493/503作為中性脂肪染料；MitoTrackerRedCMXRos作為線粒體染料；Hoechst33258作為細(xì)胞核染料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CIDE-3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物CB5存在部分共定位，CIDE-3分布于GFP-CB5所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上；CIDE-3分布于脂滴周圍，與ADRP在脂滴周圍完全重疊，說明CIDE-3是一個(gè)脂滴定位的蛋白；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)CIDE-3與線粒體不存在共定位。
　　2、攜帶CIDE-3融合基

8、因的腺病毒構(gòu)建成功
　　我們利用Stratagene公司的AdEasyTMXL腺病毒載體系統(tǒng)，經(jīng)過克隆目的基因、構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒、在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞AD293等步驟制備了攜帶CIDE-3基因的重組腺病毒。通過PCR擴(kuò)增CIDE-3，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光融合蛋白表達(dá)等方法證實(shí)重組腺病毒Ad-EGFP-CIDE-3和Ad-DsRed1-CIDE-3構(gòu)建成功。
　　3、CIDE

9、-3可以抑制脂肪酸的氧化分解，促進(jìn)脂滴成熟
　　我們采用抽脂術(shù)后的脂肪細(xì)胞乳液培養(yǎng)了原代人前脂肪細(xì)胞。并經(jīng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定初步證明其確為前脂肪細(xì)胞，具有文獻(xiàn)中提出的3個(gè)典型特征：1）來自于脂肪組織，形態(tài)為梭形，胞漿內(nèi)無或很少有脂肪顆粒；2）增殖迅速，與成纖維細(xì)胞在倍增時(shí)間上接近；3）在形成單層匯合后能變?yōu)橹炯?xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)脂肪顆粒。同時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)我們所分離培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞的CD系列抗原標(biāo)記表達(dá)特點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

10、　　在隨后的試驗(yàn)中，我們?cè)谇爸炯?xì)胞誘導(dǎo)分化的過程中分別加入重組腺病毒Ad-EGFP-CIDE-3和對(duì)照病毒Ad-EGFP。并在在熒光顯微鏡下觀察脂滴的形成及大小。被Ad-EGFP-CIDE-3感染的前脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過程中較對(duì)照組細(xì)胞脂滴聚集的數(shù)量增多，脂滴的體積明顯增大，同時(shí)脂肪細(xì)胞甘油三酯合成速度明顯升高?？梢奀IDE-3與Fsp27相同均可以通過抑制細(xì)胞甘油三酯分泌促進(jìn)其積聚最終促進(jìn)脂滴的成熟。
　　【結(jié)論】