RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和分化中的重要作用研究.pdf

1、智力障礙(ID)在神經(jīng)和精神疾病中十分常見，比如在阿爾茨海默病(AD)、自閉癥(ASD)中十分常見。智力障礙的病人的智商(IQ)往往較正常人低，小孩子伴有智力障礙者在學(xué)習(xí)語言、社會(huì)交往、自理能力方面較正常孩子緩慢。而自閉癥是一種以社會(huì)交往和溝通能力受損，重復(fù)的、刻板的行為學(xué)并常常伴有智力和認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。
　　無義介導(dǎo)的mRNA降解（NMD）是控制RNA平衡和保證大量不必要的轉(zhuǎn)錄因子快速降解的一個(gè)RNA監(jiān)控

2、機(jī)制。這個(gè)機(jī)制依賴于外顯子連接復(fù)合物(EJC)的多個(gè)核心因子：真核細(xì)胞翻譯起始因子4AIII(eIF4AIII)、腫瘤易感候選基因3(BTZ)、人類同源果蠅 Mago nashi蛋白(MAGOH)和核糖核酸結(jié)合基序蛋白8a(RBM8a)及其附近的一些因子來區(qū)分在正常轉(zhuǎn)錄的終止密碼子之前的非成熟終止密碼子(PTCs)。最近，研究表明無義介導(dǎo)的mRNA降解因子與神經(jīng)發(fā)育性障礙疾病比如自閉癥、精神分裂癥(SCZ)、智力障礙性疾病有聯(lián)系。有遺傳

3、學(xué)研究揭示NMD在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)再生、細(xì)胞增殖和分化等功能有重要的作用，然而，這些因子是如何控制大腦發(fā)育的機(jī)制尚不清楚。核糖核酸結(jié)合基序蛋白8a(RBM8a)是一個(gè)在mRNA剪接過程中與RNA結(jié)合的核蛋白，RBM8a調(diào)節(jié)的特異性調(diào)控細(xì)胞功能尤其在調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞增殖、分化和大腦發(fā)育的功能尚未被完全明確。因此，本研究擬在檢測RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和分化的功能，以明確RBM8a基因在調(diào)控大腦發(fā)育的作用，為揭示RBM8a在神經(jīng)發(fā)育障

4、礙性疾病的病因?qū)W提供理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括以下兩部分：
　　第一部分RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和分化中的作用
　　目的:檢測RBM8a在胚鼠不同階段和成年鼠之間的表達(dá)差異，在體外細(xì)胞系和胚鼠大腦中神經(jīng)祖細(xì)胞中過表達(dá)或沉默RBM8a，觀察細(xì)胞增殖和分化的改變，以明確RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和分化中的作用。
　　方法:將不同階段胚鼠和成年小鼠的大腦皮層組織分離、裂解并收集蛋白，使用wester

5、n blot進(jìn)行檢測RBM8a的表達(dá)。分離14天胚鼠大腦中的神經(jīng)祖細(xì)胞，并在體外誘導(dǎo)其分化，觀察RBM8a的變化。收集16天胚鼠大腦并進(jìn)行固定、冰凍切片，檢測胚鼠大腦皮層RBM8a表達(dá)。構(gòu)建沉默RBM8a的shRNA和過表達(dá)的RBM8a質(zhì)粒，并在CAD細(xì)胞系中證實(shí)其沉默和過表達(dá)的效果。在體外，分別用RBM8a的shRNA和過表達(dá)的RBM8a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAD細(xì)胞，并使用BrdU標(biāo)記。在體內(nèi)，利用子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)移技術(shù)，將shRNA和過表達(dá)RB

6、M8a轉(zhuǎn)移到14天的胚鼠大腦皮層的神經(jīng)祖細(xì)胞內(nèi)，并用BrdU標(biāo)記，以觀察RBM8a調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　結(jié)果:
　　1. RBM8a在胚胎早期神經(jīng)祖細(xì)胞增殖的時(shí)候，RBM8a的表達(dá)水平很高，而當(dāng)胚鼠逐漸發(fā)育，神經(jīng)祖細(xì)胞分化的時(shí)候，RBM8a的表達(dá)水平亦隨之降低。
　　2.在體外，當(dāng)神經(jīng)祖細(xì)胞分化的時(shí)候，RBM8a的水平明顯降低。在16天胚鼠大腦皮質(zhì)的室管膜層和室管膜下層，RBM8a與巢蛋白

7、陽性的神經(jīng)祖細(xì)胞中大量表達(dá)，而在雙腎上腺皮質(zhì)激素陽性的遷移神經(jīng)細(xì)胞和不成熟神經(jīng)元聚集的中間層和皮質(zhì)外層RBM8a表達(dá)明顯減少。RBM8a在CAD細(xì)胞被沉默后細(xì)胞分裂指數(shù)明顯降低，細(xì)胞增殖減少，而過表達(dá)RBM8a后，CAD細(xì)胞分裂指數(shù)明顯升高，促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　3.在動(dòng)物模型體內(nèi)，沉默胚鼠大腦皮質(zhì)中的RBM8a可見以神經(jīng)祖細(xì)胞為主室管膜層和室管膜下層的細(xì)胞減少，而增加了進(jìn)入分化的神經(jīng)元所在的中間層和皮質(zhì)外層；相反，過表達(dá)胚鼠大腦皮

8、質(zhì)中的RBM8a后，轉(zhuǎn)移至中外層的細(xì)胞減少而在室管膜層和室管膜下層的細(xì)胞增多，表明RBM8a正性調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖。
　　4.在動(dòng)物模型體內(nèi)，沉默胚鼠大腦皮質(zhì)RBM8a時(shí)，細(xì)胞周期退出指數(shù)增加32％，導(dǎo)致神經(jīng)祖細(xì)胞的減少，而分化成新生神經(jīng)元增多；相反，過表達(dá)RBM8a后，細(xì)胞周期退出指數(shù)減少30%，導(dǎo)致神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖并抑制神經(jīng)祖細(xì)胞分化成新生的神經(jīng)元。
　　結(jié)論:RBM8a基因在調(diào)節(jié)早期神經(jīng)發(fā)育扮演著重要作用；RBM8a

9、促進(jìn)胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和抑制神經(jīng)元的分化；RBM8a在維持神經(jīng)祖細(xì)胞增殖與分化的平衡中起重要作用。
　　第二部分基于RNA-seq技術(shù)對RBM8a調(diào)控的基因和信號(hào)通路分析
　　目的:通過以RNA-seq技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，識(shí)別大腦中RBM8a可能調(diào)控的神經(jīng)精神疾病相關(guān)的下游基因和信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　方法:構(gòu)建過表達(dá)RBM8a質(zhì)粒pTRIPZ-mCherry-RBM8a和對照質(zhì)粒pTRIPZ-mCherry，將它們

10、包裝慢病毒載體，構(gòu)建過表達(dá)RBM8a的SH-SY5Y穩(wěn)定細(xì)胞系，利用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)過表達(dá)RBM8a在細(xì)胞系中表達(dá)，利用TRIzol試劑提取總RNA，使用RiboZero試劑盒選擇性的去除rRNA。使用Illumina Hi-Seq2500平臺(tái)，進(jìn)行高通量RNA測序，使用軟件工具分析過表達(dá)RBM8a與對照組之間有顯著差異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。將有差異性表達(dá)的基因列表與現(xiàn)有的不同的神經(jīng)精神疾病數(shù)據(jù)庫中高?；蛳嗷φ眨R(shí)別出他們之間重疊的基因，并

11、進(jìn)一步使用western blot在CAD細(xì)胞中驗(yàn)證RNA-seq有差異表達(dá)的基因的蛋白表達(dá)是否一致。利用DAVID生物信息分析軟件，分析RBM8a下游有差異表達(dá)的基因可能參與調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)通路。最后分析本研究中有差異表達(dá)的基因是否導(dǎo)致有差別的選擇性剪接，是否有通過NMD調(diào)控的靶點(diǎn)基因。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建過表達(dá)RBM8a質(zhì)粒，提取總RNA并取出rRNA后，利用高通量RNA測序和分析，最終過表達(dá)RBM8a組和對照組

12、的mRNA測序，超過95%的閱讀都被映射到參考基因組。
　　2.通過分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)RBM8a后有7.08%的轉(zhuǎn)錄因子相對于對照組有差異。過表達(dá)RBM8a的眾多下游基因與智力障礙、阿爾茨海默病、自閉癥、精神分裂癥數(shù)據(jù)庫中的高?；蛑睾?。自閉癥高危蛋白（NLGN1），退行性神經(jīng)疾病蛋白（ATXN1），神經(jīng)再生蛋白（REST），胚胎發(fā)育（TLE4）和神經(jīng)遷移蛋白（KIF1A）在RBM8a過表達(dá)CAD細(xì)胞中表達(dá)與RNA測序結(jié)果一致，而沉

13、默RBM8a的CAD細(xì)胞中表達(dá)與RNA測序結(jié)果相反。
　　3. DAVID生物信息工具分析結(jié)果提示RBM8a調(diào)控了包括絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶等信號(hào)傳導(dǎo)通路、生長因子信號(hào)傳導(dǎo)通路、Rho信號(hào)傳導(dǎo)通路、包含整合素和膠原蛋白在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)受體傳導(dǎo)通路、鈣離子信號(hào)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的許多重要基因。
　　4.本研究中371個(gè)選擇性剪接事件中有101蛋白編碼基因有顯著性差異，這些選擇性剪接的基因中許多與自閉癥(ASD)的高?；?/p>