Rbm24在心肌細胞中的重要作用及相關(guān)信號分子初篩.pdf

1、目的：研究Rbm24在心肌分化和心肌細胞中作用的分子機制，尋找Rbm24的靶標mRNA及與其相互結(jié)合的蛋白，揭示Rbm24在干細胞心肌分化過程中的作用，為探討Rbm24敲低而導致心肌收縮受損的心肌病的相關(guān)信號通路提供一定的研究依據(jù)，并為心肌病的治療提供一個重要的新靶點。
　　方法：首先，通過qRT-PCR檢測Rbm24在ESC分化過程的表達情況。同時，采用Westernblot免疫印跡分析結(jié)合細胞免疫熒光染色檢測Rbm24在原代心

2、肌細胞、H9C2細胞系、C2C12細胞系的表達情況。然后，利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建的Rbm24敲低細胞siRNA-Rbm24，分析Rbm24敲低對心肌結(jié)構(gòu)蛋白的表達及心臟收縮的影響。最后，利用基因克隆和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定過表達Rbm24-Flag的心肌母細胞H9C2-23，采用RNA蛋白免疫沉淀芯片(RIP-CHIP)技術(shù)對Rbm24相結(jié)合的靶標mRNA進行系統(tǒng)地分析，并結(jié)合RIP-PCR進行驗證。同時，采用蛋白免疫共沉淀(CO-IP

3、)-質(zhì)譜分析技術(shù)對與Rbm24相互結(jié)合的蛋白進行系統(tǒng)地分析，并通過基因克隆技術(shù)和CO-IP進行驗證。
　　結(jié)果：在ESC分化成心肌細胞的第三天，Rbm24開始表達，心肌分化啟動，Rbm24的表達一直上調(diào)到第六天。在原代心肌細胞中，α-actinin標記的心肌細胞均顯示Rbm24表達陽性，且在核質(zhì)中均勻分布。在心肌母細胞H9C2中，Rbm24在核質(zhì)中均勻分布，誘導H9C2分化后，Rbm24蛋白表達量上調(diào)，且細胞質(zhì)中的蛋白表達量上調(diào)明

4、顯。在肌原細胞系C2C12中，Rbm24不表達，利用馬血清誘導C2C12分化成肌細胞的過程中，Rbm24表達量逐漸升高。這些數(shù)據(jù)表明Rbm24是早期心肌分化的標志物，在心肌組織中特異性表達。在心肌細胞中，Rbm24敲低將導致心肌結(jié)構(gòu)蛋白TNNT2、TPM、MYH6(α-MHC)和ACTN2的表達減少，并且使得細胞內(nèi)肌絲的形態(tài)變得不清晰，細胞的自發(fā)性收縮也減少了。這些數(shù)據(jù)表明，Rbm24在心肌功能的維持中有重要作用。RIP-CHIP技術(shù)獲

5、得了與Rbm24相結(jié)合的靶標mRNA，并通過RIP-PCR驗證Rbm24與MYOG和Stat3mRNA相結(jié)合。CO-IP結(jié)合質(zhì)譜分析獲得可能與Rbm24相互結(jié)合的蛋白，并進一步通過基因克隆與CO-IP驗證與Rbm24相互結(jié)合的蛋白。
　　結(jié)論：Rbm24在ESC分化成心肌細胞及心肌組織中特異性表達，表明Rbm24是早期心肌分化的標志物，且在心肌細胞功能和心肌收縮力的維持中有重要作用，很可能作為臨床心肌病的一個指征。Rbm24可能通