AMI血清及相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)BMSC分化為心肌細(xì)胞的作用.pdf

1、心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病，具有很高的發(fā)病率和致死率。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，受損后無(wú)法再生。雖然近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞具有一定的再生能力，但并不足以修復(fù)各種心臟疾病引起的心肌細(xì)胞損傷，心肌細(xì)胞損傷后只能通過(guò)成纖維細(xì)胞形成瘢痕組織進(jìn)行修復(fù)。繼傳統(tǒng)的藥物、手術(shù)_、溶栓、介入等方法后，細(xì)胞移植是一種目前被認(rèn)為最具有發(fā)展?jié)摿Φ闹委熜难芗膊〉男炉煼ㄖ?。用于?xì)胞移植的種子細(xì)胞種類很多，有些種子細(xì)胞如骨骼肌細(xì)胞、

2、胎兒心肌細(xì)胞等由于不能與宿主心肌細(xì)胞整合或來(lái)源有限等問(wèn)題而受到限制。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)作為成體干細(xì)胞的一種，具有來(lái)源廣泛、取材方便、免疫原性低、具有多向分化潛能等特點(diǎn)，是治療心血管疾病的良好的種子細(xì)胞來(lái)源。已有大量實(shí)驗(yàn)證明其在體內(nèi)外可以分化為心肌細(xì)胞。很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，甚至臨床試驗(yàn)證明，心肌梗死后BMSC可以在心肌梗死部位分化為心肌細(xì)胞、改善心功能。然而BMSC要真正應(yīng)用于臨床，仍有許多問(wèn)題需要解決。如目前誘導(dǎo)BMSC分化為心肌細(xì)胞

3、的具體機(jī)制仍不清楚、BMSC誘導(dǎo)分化的效率仍然很低等。大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為心肌微環(huán)境包括心肌細(xì)胞的機(jī)械牽拉作用和心肌局部分泌的各種可溶性分子在BMSC的誘導(dǎo)分化中發(fā)揮主要作用。心肌梗死發(fā)生后，心肌細(xì)胞發(fā)生壞死，引起補(bǔ)體活化、自由基產(chǎn)生、分泌各種細(xì)胞因子，患者的血清成分也發(fā)生改變。這些改變究竟對(duì)BMSC向心肌細(xì)胞分化存在怎樣的影響目前尚未完全清楚。為對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行探討，我們制作大鼠急性心肌梗死(AMI)模型后，提取大鼠AMI后24小時(shí)血清(AMI

4、大鼠血清)，運(yùn)用體外誘導(dǎo)的方法，觀察AMI大鼠血清對(duì)BMSC向心肌細(xì)胞分化的影響。另外通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)分析，發(fā)現(xiàn)心肌梗死發(fā)生后患者血清中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)水平升高，而且這兩種細(xì)胞因子在胚胎發(fā)育時(shí)期的心肌形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并已有研究證實(shí)TGFβ1能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，bFGF?？梢源龠M(jìn)心肌梗死后血管再生，那么這兩種細(xì)胞因子對(duì)BMSC分化為心肌細(xì)胞又存在怎樣的影響呢?我們?cè)?/p>

5、上述研究的基礎(chǔ)上又進(jìn)一步對(duì)bFGF、TGFβ1在BMSC向心肌細(xì)胞分化中的作用進(jìn)行了研究。希望通過(guò)分析AMI大鼠血清及其相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)BMSC分化為心肌細(xì)胞的影響，一方面了解BMSC分化為心肌細(xì)胞的機(jī)制，另一方面尋找一種提高BMSC分化效率的有效誘導(dǎo)方法。 第1章 大鼠急性心肌梗死模型制備及其血清獲取 1目的：制作大鼠急性心肌梗死模型，獲取大鼠急性心肌梗死24 h血清。 2材料與方法： 選擇7～8周齡SD

6、大鼠，10﹪水合氯醛腹腔麻醉，接小動(dòng)物呼吸機(jī)、BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，左側(cè)3～4肋間開胸暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎后24 h心臟取血，4℃1500 rpm離心10 min,獲取急性心肌梗死大鼠血清。取大鼠心臟，病理檢測(cè)心肌梗死區(qū)心肌損傷及炎癥反應(yīng)情況。 3結(jié)果： 大鼠左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后QRS波出現(xiàn)低平，T波高聳，提示心肌發(fā)生缺血性改變。HE染色發(fā)現(xiàn)心肌梗死區(qū)心肌缺血壞死、心肌纖維斷裂，有大量中性粒細(xì)胞為主的

7、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。證實(shí)大鼠急性心肌梗死動(dòng)物模型制作成功。 4結(jié)論： 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法經(jīng)過(guò)一定的技術(shù)改進(jìn)后成功率高，是一種比較理想的制作大鼠急性心肌梗死模型的方法。 第2章 急性心肌梗死大鼠血清對(duì)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的作用 1目的：探討AMI大鼠血清在體外對(duì)大鼠BMSC分化為心肌細(xì)胞的作用。 2材料與方法： 2．1大鼠BMSC的分離純化 采用直接貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSC,經(jīng)過(guò)

8、換液和傳代，獲得第3代(P3)細(xì)胞。運(yùn)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)P3 BMSC細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)情況，并運(yùn)用成骨、成脂誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)BMSC的多向分化潛能進(jìn)行鑒定。 2．2 AMI大鼠血清對(duì)大鼠BMSC分化為心肌細(xì)胞的作用 取一定量大鼠BMSC以1×10<'4>/ml分別接種于24孔培養(yǎng)板和6孔培養(yǎng)板中，分為6組：Ⅰ組為對(duì)照組：Ⅱ組為5-氮胞苷(5-aza)誘導(dǎo)組；Ⅲ組為5-aza+AMI大鼠血清誘導(dǎo)組；Ⅳ組為5-aza+正

9、常大鼠血清誘導(dǎo)組；V組為AMI大鼠血清誘導(dǎo)組；Ⅵ組為正常大鼠血清誘導(dǎo)組。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，誘導(dǎo)30 d后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行鑒定：免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)心肌肌鈣蛋白(cTnT)表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和結(jié)蛋白(desmin)的表達(dá)。 3結(jié)果： 大鼠BMSC原代培養(yǎng)3 d即有克隆形成，7～8d可長(zhǎng)滿傳代。經(jīng)換液和傳代，P3 BMSC形態(tài)均一，CD29、CD44陽(yáng)性，CD45、CDllb陰性

10、，用成骨、成脂誘導(dǎo)液分別進(jìn)行誘導(dǎo)，可分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。用5-aza或5-aza聯(lián)合大鼠血清誘導(dǎo)P3大鼠BMSC后，部分細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞，其eTnT表達(dá)陽(yáng)性，GATA-4、desmin表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào)。對(duì)照組和單獨(dú)血清誘導(dǎo)組的BMSC則未見有明顯形態(tài)改變，其cTnT亦為陰性，但GATA-4、desmin卻呈弱陽(yáng)性。其中5-aza聯(lián)合AMI大鼠血清誘導(dǎo)組BMSC分化效率高于單獨(dú)5-aza誘導(dǎo)組(P<0.01)，5-aza

11、聯(lián)合正常大鼠血清誘導(dǎo)組分化效率與5=aza誘導(dǎo)組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外5-aza聯(lián)合AMI或正常大鼠血清誘導(dǎo)組在誘導(dǎo)2周后可觀察到部分細(xì)胞呈緩慢而有節(jié)律的跳動(dòng)，而單純5．a(chǎn)za誘導(dǎo)組未見細(xì)胞跳動(dòng)。 4結(jié)論： (1)直接貼壁法是一種簡(jiǎn)單、可行的分離培養(yǎng)大鼠BMSC的方法。 (2)單純用AMI大鼠血清不能誘導(dǎo)BMSC分化為心肌細(xì)胞，但AMI血清能促進(jìn)5-aza誘導(dǎo)的BMSC向心肌細(xì)胞分化，并促進(jìn)

12、分化的心肌細(xì)胞成熟。 第3章 bFGF和TGFpl對(duì)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的作用 1目的： 觀察堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1對(duì)大鼠BMSC分化為心肌細(xì)胞的作用。 2材料和方法： 分離培養(yǎng)大鼠BMSC，取一定量BMSC以1 × 10<'4>/ml分別接種于24孔培養(yǎng)板和6孔培養(yǎng)板中，24 h后換液并分組：Ⅰ組為對(duì)照組：Ⅱ組為5-aza誘導(dǎo)組；Ⅲ組為5-aza+bFGF誘導(dǎo)組

13、；Ⅳ組為5-aza+TGFβ1誘導(dǎo)組。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化，誘導(dǎo)30 d后應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)各組細(xì)胞cTnT、的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、結(jié)構(gòu)蛋白desmin的表達(dá)，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞跳動(dòng)情況。 3結(jié)果： 大鼠BMSC經(jīng)5-aza、5-aza+bFGF或5-aza+TGFβ1誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體變細(xì)伸長(zhǎng)，呈典型的肌纖維樣結(jié)構(gòu)，5-azal+bFGF

14、誘導(dǎo)組較另外兩組誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯，并有細(xì)胞呈心肌樣細(xì)胞跳動(dòng)，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組部分細(xì)胞cTnT表達(dá)陽(yáng)性，GATA-4和desmin表達(dá)明顯上調(diào)。5-aza+bFGF誘導(dǎo)組：BMSC分化效率高于單獨(dú)5-aza誘導(dǎo)組和5-aza+TGFβ1誘導(dǎo)組(P<0.05)，5-aza+TGFβ1誘導(dǎo)組BMSC分化效率和單獨(dú)5-aza誘導(dǎo)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4結(jié)論： bFGF有協(xié)同5