AMI血清及相關細胞因子對BMSC分化為心肌細胞的作用.pdf

1、心血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的常見疾病，具有很高的發(fā)病率和致死率。傳統(tǒng)觀念認為，心肌細胞是終末分化細胞，受損后無法再生。雖然近年來有研究發(fā)現心肌細胞具有一定的再生能力，但并不足以修復各種心臟疾病引起的心肌細胞損傷，心肌細胞損傷后只能通過成纖維細胞形成瘢痕組織進行修復。繼傳統(tǒng)的藥物、手術_、溶栓、介入等方法后，細胞移植是一種目前被認為最具有發(fā)展?jié)摿Φ闹委熜难芗膊〉男炉煼ㄖ弧Ｓ糜诩毎浦驳姆N子細胞種類很多，有些種子細胞如骨骼肌細胞、

2、胎兒心肌細胞等由于不能與宿主心肌細胞整合或來源有限等問題而受到限制。骨髓間質干細胞(BMSC)作為成體干細胞的一種，具有來源廣泛、取材方便、免疫原性低、具有多向分化潛能等特點，是治療心血管疾病的良好的種子細胞來源。已有大量實驗證明其在體內外可以分化為心肌細胞。很多動物實驗，甚至臨床試驗證明，心肌梗死后BMSC可以在心肌梗死部位分化為心肌細胞、改善心功能。然而BMSC要真正應用于臨床，仍有許多問題需要解決。如目前誘導BMSC分化為心肌細胞

3、的具體機制仍不清楚、BMSC誘導分化的效率仍然很低等。大多數觀點認為心肌微環(huán)境包括心肌細胞的機械牽拉作用和心肌局部分泌的各種可溶性分子在BMSC的誘導分化中發(fā)揮主要作用。心肌梗死發(fā)生后，心肌細胞發(fā)生壞死，引起補體活化、自由基產生、分泌各種細胞因子，患者的血清成分也發(fā)生改變。這些改變究竟對BMSC向心肌細胞分化存在怎樣的影響目前尚未完全清楚。為對此問題進行探討，我們制作大鼠急性心肌梗死(AMI)模型后，提取大鼠AMI后24小時血清(AMI

4、大鼠血清)，運用體外誘導的方法，觀察AMI大鼠血清對BMSC向心肌細胞分化的影響。另外通過對文獻進行總結分析，發(fā)現心肌梗死發(fā)生后患者血清中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉化生長因子β1(TGFβ1)水平升高，而且這兩種細胞因子在胚胎發(fā)育時期的心肌形成過程中發(fā)揮重要作用，并已有研究證實TGFβ1能促進胚胎干細胞向心肌細胞的分化，bFGF。可以促進心肌梗死后血管再生，那么這兩種細胞因子對BMSC分化為心肌細胞又存在怎樣的影響呢?我們在

5、上述研究的基礎上又進一步對bFGF、TGFβ1在BMSC向心肌細胞分化中的作用進行了研究。希望通過分析AMI大鼠血清及其相關細胞因子對BMSC分化為心肌細胞的影響，一方面了解BMSC分化為心肌細胞的機制，另一方面尋找一種提高BMSC分化效率的有效誘導方法。 第1章 大鼠急性心肌梗死模型制備及其血清獲取 1目的：制作大鼠急性心肌梗死模型，獲取大鼠急性心肌梗死24 h血清。 2材料與方法： 選擇7～8周齡SD

6、大鼠，10﹪水合氯醛腹腔麻醉，接小動物呼吸機、BL-420生物機能實驗系統(tǒng)，左側3～4肋間開胸暴露心臟，結扎左冠狀動脈前降支。結扎后24 h心臟取血，4℃1500 rpm離心10 min,獲取急性心肌梗死大鼠血清。取大鼠心臟，病理檢測心肌梗死區(qū)心肌損傷及炎癥反應情況。 3結果： 大鼠左冠狀動脈結扎后QRS波出現低平，T波高聳，提示心肌發(fā)生缺血性改變。HE染色發(fā)現心肌梗死區(qū)心肌缺血壞死、心肌纖維斷裂，有大量中性粒細胞為主的

7、炎癥細胞浸潤。證實大鼠急性心肌梗死動物模型制作成功。 4結論： 冠狀動脈結扎法經過一定的技術改進后成功率高，是一種比較理想的制作大鼠急性心肌梗死模型的方法。 第2章 急性心肌梗死大鼠血清對大鼠骨髓間質干細胞分化為心肌細胞的作用 1目的：探討AMI大鼠血清在體外對大鼠BMSC分化為心肌細胞的作用。 2材料與方法： 2．1大鼠BMSC的分離純化 采用直接貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSC,經過

8、換液和傳代，獲得第3代(P3)細胞。運用流式細胞儀技術檢測P3 BMSC細胞表面標志表達情況，并運用成骨、成脂誘導液進行誘導，對BMSC的多向分化潛能進行鑒定。 2．2 AMI大鼠血清對大鼠BMSC分化為心肌細胞的作用 取一定量大鼠BMSC以1×10<'4>/ml分別接種于24孔培養(yǎng)板和6孔培養(yǎng)板中，分為6組：Ⅰ組為對照組：Ⅱ組為5-氮胞苷(5-aza)誘導組；Ⅲ組為5-aza+AMI大鼠血清誘導組；Ⅳ組為5-aza+正

9、常大鼠血清誘導組；V組為AMI大鼠血清誘導組；Ⅵ組為正常大鼠血清誘導組。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，誘導30 d后對各組細胞進行鑒定：免疫細胞化學染色檢測心肌肌鈣蛋白(cTnT)表達，RT-PCR檢測心肌細胞轉錄因子GATA-4和結蛋白(desmin)的表達。 3結果： 大鼠BMSC原代培養(yǎng)3 d即有克隆形成，7～8d可長滿傳代。經換液和傳代，P3 BMSC形態(tài)均一，CD29、CD44陽性，CD45、CDllb陰性

10、，用成骨、成脂誘導液分別進行誘導，可分化為成骨細胞和脂肪細胞。用5-aza或5-aza聯(lián)合大鼠血清誘導P3大鼠BMSC后，部分細胞分化為心肌樣細胞，其eTnT表達陽性，GATA-4、desmin表達水平較對照組明顯上調。對照組和單獨血清誘導組的BMSC則未見有明顯形態(tài)改變，其cTnT亦為陰性，但GATA-4、desmin卻呈弱陽性。其中5-aza聯(lián)合AMI大鼠血清誘導組BMSC分化效率高于單獨5-aza誘導組(P<0.01)，5-aza

11、聯(lián)合正常大鼠血清誘導組分化效率與5=aza誘導組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。另外5-aza聯(lián)合AMI或正常大鼠血清誘導組在誘導2周后可觀察到部分細胞呈緩慢而有節(jié)律的跳動，而單純5．aza誘導組未見細胞跳動。 4結論： (1)直接貼壁法是一種簡單、可行的分離培養(yǎng)大鼠BMSC的方法。 (2)單純用AMI大鼠血清不能誘導BMSC分化為心肌細胞，但AMI血清能促進5-aza誘導的BMSC向心肌細胞分化，并促進

12、分化的心肌細胞成熟。 第3章 bFGF和TGFpl對大鼠骨髓間質干細胞誘導分化為心肌細胞的作用 1目的： 觀察堿性成纖維細胞生長因子和轉化生長因子β1對大鼠BMSC分化為心肌細胞的作用。 2材料和方法： 分離培養(yǎng)大鼠BMSC，取一定量BMSC以1 × 10<'4>/ml分別接種于24孔培養(yǎng)板和6孔培養(yǎng)板中，24 h后換液并分組：Ⅰ組為對照組：Ⅱ組為5-aza誘導組；Ⅲ組為5-aza+bFGF誘導組

13、；Ⅳ組為5-aza+TGFβ1誘導組。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態(tài)變化，誘導30 d后應用免疫細胞化學染色檢測各組細胞cTnT、的表達，RT-PCR檢測心肌細胞轉錄因子GATA-4、結構蛋白desmin的表達，并在倒置顯微鏡下觀察細胞跳動情況。 3結果： 大鼠BMSC經5-aza、5-aza+bFGF或5-aza+TGFβ1誘導后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體變細伸長，呈典型的肌纖維樣結構，5-azal+bFGF

14、誘導組較另外兩組誘導組細胞形態(tài)變化更加明顯，并有細胞呈心肌樣細胞跳動，對照組細胞形態(tài)未見明顯變化。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組部分細胞cTnT表達陽性，GATA-4和desmin表達明顯上調。5-aza+bFGF誘導組：BMSC分化效率高于單獨5-aza誘導組和5-aza+TGFβ1誘導組(P<0.05)，5-aza+TGFβ1誘導組BMSC分化效率和單獨5-aza誘導組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 4結論： bFGF有協(xié)同5