人胚胎干細胞體外分化為脊髓運動神經(jīng)元祖細胞過程中MicroRNA及基因表達譜的研究.pdf

1、目的：
　　通過研究人胚胎干細胞體外定向分化為脊髓運動神經(jīng)元祖細胞過程中microRNA及mRNA的表達譜情況，篩選差異表達microRNA及mRNA，并對感興趣microRNA及其靶mRNA進行real-time PCR驗證，從而試圖發(fā)現(xiàn)一些調控人胚胎干細胞向脊髓運動神經(jīng)元祖細胞分化過程中的關鍵microRNA及mRNA，為運動神經(jīng)元損傷及再生提供新的治療靶點。
　　方法：
　　使用小分子化合物SB4315422μM

2、、LDN1931890.3μM、CHIR990212mM及化學成分限定培養(yǎng)體系于體外在飼養(yǎng)層細胞的支持作用下先將人胚胎干細胞定向誘導分化為神經(jīng)上皮細胞。上述三種小分子化合物（濃度不變）再結合另外兩種小分子化合物RA0.1μM，Purmorphamine0.5μM在新鮮飼養(yǎng)層細胞的支持下將神經(jīng)上皮細胞誘導分化為脊髓運動神經(jīng)元祖細胞，然后撤去SB431542、LDN193189、CHIR99021，保留RA、Purmorphamine(濃度

3、不變)懸浮培養(yǎng)一周提高純度，收集hESC及神經(jīng)上皮、脊髓運動神經(jīng)元祖細胞這三個關鍵時期標本，進行RNA抽提，對RNA進行質量檢測后分別進行microRNA和mRNA表達譜檢測；使用miRanda、miRbase、targetScan數(shù)據(jù)庫對所檢microRNA進行靶基因預測；將預測所得靶基因和所檢mRNA芯片聯(lián)合分析；對mRNA芯片進行生物信息學分析，信號通路分析，構建microRNA調控網(wǎng)絡圖。挑選不同分化階段差異表達microRNA

4、及相應靶基因，進行real-time PCR驗證。
　　結果：
　?。?）人胚胎干細胞向神經(jīng)上皮細胞分化過程中microRNA表達譜及基因表達譜發(fā)生明顯改變。347個microRNA下調大于2倍，134個microRNA上調大于2倍。對應的基因芯片中，2252個基因上調表達大于2倍；2404個基因下調表達大于2倍。Hsa-miR-141-3p下調解除了對ZEB2的抑制，hsa-miR-365b-3p下調解除了對PAX6的抑制

5、參與人胚胎干細胞分化為神經(jīng)上皮細胞。
　　（2）神經(jīng)上皮細胞向脊髓運動神經(jīng)元祖細胞分化過程中microRNA及基因表達譜發(fā)生明顯改變：189個microRNA表達下調大于2倍；298個microRNA上調大于2倍。對應的基因芯片中，6098個基因上調表達大于2倍；5963個基因下調表達大于2倍。hsa-miR-93上調抑制了PTEN基因的表達，從而參與神經(jīng)上皮細胞向脊髓運動神經(jīng)元的分化。Hsa-miR-9-3p、hsa-miR-3

6、0e-3p表達下調，其分別對應的靶基因HOXB4、NKX6-1 real-time PCR證實表達均上調，提示上述microRNA表達下調解除了對其靶基因的抑制從而參與神經(jīng)上皮細胞向脊髓運動神經(jīng)元祖細胞的分化。
　　結論：
　?。?）Hsa-miR-342-5p,hsa-miR-345-3p,ZEB2等大量的microRNA及基因參與了人脊髓運動神經(jīng)元祖細胞的發(fā)育。
　?。?）Hsa-miR-141-3p下調解除了對Z