FOXO3a基因在肝細胞肝癌細胞增殖、轉化及轉移中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分、FOXO3a在血清素促進肝細胞肝癌細胞增殖中的作用及機制研究實驗
　　目的:外周血清素(5-羥色胺)在肝細胞肝癌的發(fā)生及促增殖過程中起到重要作用，然而血清素是如何發(fā)揮其促進增殖作用的機制尚未清楚。FOXO3a是一個參與多種細胞關鍵信號通路的重要轉錄因子，在本研究中，我們將探尋FOXO3a是否在血清素介導的肝細胞肝癌細胞增殖的通路中發(fā)揮作用及其機制。
　　材料與方法:選取3種肝細胞肝癌細胞系（HuH-7、 HepG2

2、和Hep3B），利用細胞活性檢測試劑盒(CCK-8)、細胞增殖檢測試劑盒(Edu)及流式細胞周期檢測分別檢測血清素在有血清及無血清培養(yǎng)條件下對3種細胞系的細胞活力及增殖情況的影響，并且同時測量不同條件下細胞內(nèi)FOXO3a的mRNA、蛋白的磷酸化表達、細胞定位及FOXO3a上游調(diào)控因子AKT的磷酸化表達。利用RNAi干擾技術和細胞質粒轉染技術分別抑制和上調(diào)3種肝細胞肝癌細胞系中FOXO3a的表達，觀察此時血清素在不同培養(yǎng)條件下細胞活力、增

3、殖及細胞內(nèi)FOXO3a的mRNA及蛋白表達變化。檢測不同培養(yǎng)條件下血清素2B受體的表達，并且利用其特異性抑制劑觀察對血清素促增殖作用的影響及肝細胞肝癌細胞內(nèi)FOXO3a的表達變化。
　　結果:3種細胞系在無血清的培養(yǎng)條件下其細胞增殖受到嚴重抑制，血清素在無血清的培養(yǎng)條件下可以逆轉HuH-7細胞的增殖抑制，但在加入血清的培養(yǎng)體系中不能起到促使HuH-7細胞增殖的效果;血清素不能逆轉血清剝離環(huán)境中HepG2和Hep3B細胞的增殖抑制。

4、血清剝離顯著下調(diào)了3種細胞FOXO3a的表達，加入血清素可以顯著上調(diào)HuH-7細胞FOXO3a的表達但對HepG2和Hep3B細胞FOXO3a的表達則無影響。血清素上調(diào)了血清剝離環(huán)境中HuH-7細胞的FOXO3a及其上游激酶AKT的磷酸化水平，但對FOXO3a的核定位卻無影響;血清素不能改變血清剝離環(huán)境中HepG2和Hep3B細胞的FOXO3a的磷酸化表達。非磷酸化FOXO3a的質?？梢燥@著上調(diào)FOXO3a的表達并且促使血清剝離環(huán)境中3

5、種細胞的增殖;而干擾FOXO3a的表達促進了血清剝離環(huán)境對3種細胞的增殖抑制作用。相較于HepG2和Hep3B細胞，血清素2B受體在HuH-7細胞中高表達，其特異性抑制劑干擾了血清素誘導的HuH-7細胞FOXO3a的上調(diào)并逆轉了其促增殖作用。
　　結論:本研究結果表明，在血清剝離環(huán)境中FOXO3a是肝細胞肝癌細胞的促增殖因子，血清素通過上調(diào)肝細胞肝癌細胞的FOXO3a起到促進細胞增殖的作用并且血清素的增殖作用是血清素2B受體介導的

6、。以肝細胞肝癌細胞中血清素-血清素2B受體-FOXO3a通路為靶點的開發(fā)藥物可以為肝細胞肝癌的治療提供新的思路。
　　第二部分、FOXO3a在多柔比星誘導肝細胞肝癌細胞發(fā)生上皮間質轉化中的作用及機制研究實驗
　　目的:肝細胞肝癌治療中經(jīng)常發(fā)生的肝細胞肝癌化療耐藥是導致肝細胞肝癌死亡率一直居高不下的重要原因。多柔比星是肝細胞肝癌化療中最為常用的藥物之一，而肝細胞肝癌細胞常發(fā)生的上皮間質細胞轉化是造成肝細胞肝癌對多柔比星耐藥的主

7、要原因。鹽霉素是一種離子載體類抗生素，其可以選擇性殺傷腫瘤干細胞。在本研究中，我們將探索鹽霉素是否與多柔比星可以發(fā)揮協(xié)同殺傷肝細胞肝癌細胞的作用及其中的內(nèi)在機制。
　　材料與方法:選取4種肝細胞肝癌細胞系（HuH-7、HepG2、SNU-449和SNU-387），利用細胞活力檢測試劑盒與蛋白免疫印跡技術檢測肝細胞肝癌細胞在多柔比星單用或多柔比星聯(lián)和鹽霉素處理后的細胞活力和上皮間質細胞轉化的相關蛋白指標。利用蛋白免疫印跡技術及細胞免

8、疫熒光檢測肝細胞肝癌細胞在多柔比星單用或多柔比星聯(lián)和鹽霉素處理后FOXO3a的表達水平、磷酸化水平及亞細胞定位。利用質粒轉染或者FOXO3a siRNA技術上調(diào)或者抑制FOXO3a的表達，觀察肝細胞肝癌細胞對多柔比星單用或多柔比星聯(lián)和鹽霉素處理的細胞活性及上皮間質轉化相關蛋白指標的表達變化。利用細胞免疫共沉淀技術觀察FOXO3a與對促進肝細胞肝癌細胞發(fā)生上皮間質轉化的重要因子β-catenin的相互結合情況及β-catenin/TCF靶

9、基因(ZEB1、c-Myc和CyclinD1)的表達情況。最后，我們建立了裸鼠肝細胞肝癌異種移植瘤模型，在體內(nèi)檢測了鹽霉素是否與多柔比星發(fā)揮協(xié)同殺傷肝細胞肝癌細胞的作用。
　　結果:多柔比星顯著上調(diào)了肝細胞肝癌細胞間質表型標志蛋白vimentin的表達，下調(diào)了上皮表型標志蛋白E-cadherin的表達;鹽霉素可以逆轉多柔比星作用后肝細胞肝癌細胞所發(fā)生的上皮間質轉化相關蛋白的表達變化并且顯著增強了多柔比星的細胞毒性。此外，多柔比星導

10、致肝細胞肝癌細胞FOXO3a磷酸化水平的上調(diào)，導致FOXO3a的細胞質定植;鹽霉素可以逆轉多柔比星誘導的FOXO3a磷酸化并且使FOXO3a在細胞核內(nèi)積聚。抑制FOXO3a的表達使鹽霉素不能逆轉多柔比星引起的肝細胞肝癌細胞上皮間質轉化并且破壞了鹽霉素對多柔比星的促殺傷作用，而過表達活化的FOXO3a抑制了多柔比星誘導的肝細胞肝癌細胞上皮間質轉化并且顯著的增強了其對多柔比星的感敏性。β-catenin/TCF的相互作用及其調(diào)控的下游因子的

11、表達是多柔比星誘導肝細胞肝癌細胞發(fā)生上皮間質轉化的關鍵因子，β-catenin/TCF結合特異性抑制劑PKF118-310抑制了多柔比星誘導的肝細胞肝癌細胞上皮間質轉化并且顯著的增強了其對多柔比星的感敏性。過表達活化的FOXO3a或鹽霉素處理促使FOXO3a/β-catenin的相互結合，使β-catenin/TCF失偶聯(lián)，并且抑制了TCF4依賴性下游靶基因的轉錄，干擾了上皮間質轉化。
　　結論:本研究表明多柔比星誘導的FOXO3