COPS3基因在肝癌細胞增殖中的功能研究.pdf

1、目的：COPS3(COP9 signalosome complex subunit3,CSN3)基因是COP9信號復合體(COP9 signalosome complex)的第三個亞基,位于人類17號染色體。近年來的研究發(fā)現(xiàn)染色體17p的擴增與p53位點的雜合子丟失、p53等位基因缺失與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系。已有研究表明,高度惡性骨腫瘤樣本中可以檢測到COPS3擴增及過表達。而目前尚未有COPS3基因是否參與肝癌發(fā)生的報道。本研

2、究探討COPS3基因在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。
　　方法：采用免疫組化法,檢測30例肝癌組織和30例肝硬化組織中COPS3蛋白的表達水平和細胞內定位。采用RNA干擾技術,設計COPS3基因靶向小干擾RNA序列,構建小發(fā)夾RNA(shRNA),重組含有COPS3 shRNA的慢病毒表達載體,與慢病毒包裝輔助質粒共轉染293T細胞,包裝慢病毒,測定病毒滴度并通過Western Blot方法驗證有效的siRNA靶序列。選擇最佳的siRN

3、A序列,包裝慢病毒感染SMMC-7721和Hep3B肝癌細胞,進行體外MTT、BrdU、克隆形成、細胞周期、細胞凋亡檢測,并建立肝癌移植小鼠模型,進行成瘤實驗。為進一步探討COPS3在肝癌細胞增殖和凋亡中的作用,利用Western Blot方法檢測凋亡相關蛋白表達,初步探討COPS3基因調節(jié)肝癌細胞增殖的分子機制。
　　結果：免疫組化結果表明,COPS3蛋白在肝癌組織中和肝硬化組織中的表達高于正常肝組織,且肝癌組織中的表達顯著高于

4、肝硬化組織;COPS3蛋白在癌變的肝組織中主要定位于細胞核,而在正常肝組織中主要定位于細胞漿。為探討COPS3基因在肝癌細胞生長中的作用,設計COPS3靶向shRNA序列,包裝成滴度為2×108TU/ml慢病毒,有效感染SMMC-7721和Hep3B肝癌細胞,并在mRNA和蛋白水平下調肝癌細胞COPS3的表達。COPS3沉默導致肝癌細胞活力,DNA合成水平、克隆形成能力顯著降低,并引起細胞周期阻滯于G0/G1期,同時誘導肝癌細胞凋亡。C

5、OPS3沉默還可導致裸鼠體內肝癌移植瘤的生長減緩。此外,COPS3下調的肝癌細胞中,凋亡分子Caspase8、BIK的表達上調、PARP蛋白發(fā)生裂解。
　　結論：COPS3在肝癌組織中表達水平和定位均發(fā)生改變,可能參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程。COPS3沉默(COPS3 shRNA)可誘導肝癌細胞周期阻滯、調節(jié)Caspase8、PARP和BIK的活性,促進肝癌細胞凋亡,抑制肝癌細胞增殖,結果提示COPS3基因是促進肝癌細胞生長的癌基因