HBV中和抗體篩選分析.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)作為乙型肝炎(Hepatitis B,HB)的致病因素,自發(fā)現(xiàn)以來一直威脅著人類的健康與生命安全。高達(dá)20億的感染基數(shù)與每年100萬的相關(guān)死亡人口,使HBV成為最重要的肝炎病毒之一。隨著上世紀(jì)末乙型肝炎疫苗與免疫球蛋白(Hepatitis B immuile globulin,HBIG)的大規(guī)模推廣應(yīng)用,HBV的流行傳播得到有效控制。但免疫壓力的增強(qiáng)也導(dǎo)致病毒產(chǎn)生了許多免疫逃逸突

2、變毒株,這些逃逸突變主要出現(xiàn)于乙肝的主要免疫靶點(diǎn)“a”表位上。對(duì)這種突變病毒,原有的疫苗與HBIG無法提供足夠的保護(hù)效果。這就需要一個(gè)廣譜的疫苗與治療性抗體來預(yù)防、阻斷逃逸突變HBV的感染。
　　 本研究利用支持HBV早期感染過程的HepG2細(xì)胞構(gòu)建了一個(gè)簡(jiǎn)單可靠的HBV中和抗體快速篩選模型。將目標(biāo)抗體與HBV共孵育于培養(yǎng)細(xì)胞中,通過抗體對(duì)HBV吸附HepG2細(xì)胞的阻斷效果,來評(píng)價(jià)抗體的中和活性。
　　 利用這一方案,我

3、們檢測(cè)了前期所制備的HBV單克隆抗體庫中150余株單抗的中和活性,并從中篩選出一批具有較高中和活性的單抗。通過測(cè)試這些中和單抗與常見免疫逃逸突變病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface protein antigens,HBsAg)間的親和力變化,本研究發(fā)現(xiàn)的14株高中和活性單抗中,8株受大部分突變影響,親和力下降,表明這8株單抗為識(shí)別HBsAg“a”表位的構(gòu)象性單抗(抗乙肝免疫中和活性的主要靶點(diǎn))。2株單抗只受

4、“a”表位loop1附近(aa119～124)部分突變影響。而有4株不受乙肝常見的“a”表位免疫逃逸突變的影響,與各種逃逸突變HBsAg間保持了較好的親和力。本研究還發(fā)現(xiàn),在所有常見的免疫逃逸突變中C124Y顯得最為重要,對(duì)C124Y突變不敏感的單抗對(duì)其它逃逸突變也能保持較好的反應(yīng)活性。
　　 本研究進(jìn)一步檢測(cè)了這些與逃逸突變蛋白間保持了良好反應(yīng)性的單抗的廣譜中和活性,并最終找到3株中和單抗對(duì)常見的免疫逃逸HBV毒株均有較好的中

5、和活性。其中兩株單抗為針對(duì)“a”表位loop1 N端的線性抗體。由此確定在“a”表位loop1 N端存在一個(gè)較為保守的線性中和表位,它對(duì)常見逃逸突變均有效。同時(shí)“a”表位外亦存在一些中和表位。它們因?yàn)殡x“a”表位較遠(yuǎn),所以不受“a”表位突變影響。另一株單抗和依據(jù)小S蛋白(Small HBV Surface Protein Antigens,SHBs)設(shè)計(jì)的所有15肽步進(jìn)合成肽均不反應(yīng),表明該單抗識(shí)別表位很可能是構(gòu)象表位,同時(shí)該單抗對(duì)常見

6、“a”表位突變并不敏感,這表明其結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)獨(dú)立于“a”表位外的構(gòu)象區(qū)域,雖然暫時(shí)無法確定具體識(shí)別位點(diǎn),但該表位很可能是一個(gè)較為獨(dú)特的新中和表位。
　　 逃逸突變是HBV防控環(huán)節(jié)的重要問題之一。本研究所發(fā)現(xiàn)的3株中和單抗,對(duì)常見的免疫逃逸突變毒株均有較好的中和活性,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這3株單抗識(shí)別“a”表位loop1 N端線性表位或一個(gè)非“a”表位的構(gòu)象表位,這些發(fā)現(xiàn)為尋找HBV的廣譜中和表位提供了工具和方向。對(duì)這3株單抗及其識(shí)別