普通人群血清中的腺病毒中和抗體調(diào)查及3型腺病毒中和表位的鑒定和分析.pdf

1、腺病毒(Adenovirus，Adv)感染在全球范圍內(nèi)廣泛流行，具有傳染性強(qiáng)，宿主范圍廣的特點(diǎn)。腺病毒不僅是呼吸道感染、結(jié)膜感染和腸道感染較為常見的病原體之一，它們還可能引起無菌性腦膜炎、心肌炎、腦炎和肝炎等。對于移植手術(shù)患者、HIV感染者等免疫功能低下的人群，腺病毒更是常見感染因素之一。因此，對于腺病毒感染的預(yù)防、診斷和治療一直都是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。
　　 人類腺病毒屬于腺病毒科(Adenoviridae)的哺乳動物腺

2、病毒屬（Mastade novirus）。人類腺病毒根據(jù)不同的免疫學(xué)、生物和生化特性分為7個亞群（A至G），至今國際病毒分類委員會(ICTV)已經(jīng)公布57種血清型。在2011年，有科學(xué)家報道發(fā)現(xiàn)了58型腺病毒，但還未通過ICTV的鑒定。不同血清型的腺病毒宿主嗜性不同，因此表現(xiàn)出不同的臨床癥狀。B組的3型和7型腺病毒以及E組的4型腺病毒是呼吸道感染的常見病毒，常引起下呼吸道感染癥狀如發(fā)熱，咳嗽和肺炎等，以及在夏季引起咽結(jié)膜性發(fā)熱的爆發(fā)感染

3、。國內(nèi)在2004-2005年間多地區(qū)暴發(fā)了3型腺病毒感染，流行范圍包括江蘇、北京、湖北等地;廣州在2004年也報道了一起幼兒園咽結(jié)膜性發(fā)熱感染;山西省2009年暴發(fā)了一起7型腺病毒感染，該病毒引起嬰兒嚴(yán)重下呼吸道癥狀;2008-2009年，3型腺病毒在加拿大NewBrunswick省暴發(fā)流行，幾百人被感染，甚至有3名病人死亡;在美國新兵訓(xùn)練營和老年看護(hù)機(jī)構(gòu)都報道有4型腺病毒的感染。
　　 目前，腺病毒感染和其他病毒性感染疾病一樣

4、，沒有特效藥物及療效顯著的治療方法，主要依靠機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的抵抗反應(yīng)，消滅病毒而痊愈。先前的研究已表明，機(jī)體產(chǎn)生的腺病毒抗體對同型腺病毒具有長久而穩(wěn)定的保護(hù)性。因此，開發(fā)高效、安全低價的腺病毒疫苗是預(yù)防腺病毒感染的有效方法。70年代初，美國軍隊(duì)曾在新兵訓(xùn)練時期使用Adv4-Adv7口服疫苗，使腺病毒相關(guān)的呼吸道疾病得到了有效的遏制。1999年，疫苗停止供應(yīng)后，新兵訓(xùn)練中心監(jiān)測發(fā)現(xiàn)呼吸道感染率明顯上升。直到2011年經(jīng)FDA批準(zhǔn)啟用新的

5、Adv4-Adv7口服疫苗，再次有效降低了呼吸道感染疾病的發(fā)生。但由于口服活疫苗經(jīng)糞便排出后仍具有傳染的可能性;同時服用兩種或以上不同亞型的腺病毒疫苗可能進(jìn)行同源重組而產(chǎn)生新型病毒，帶來新的感染風(fēng)險，故國外只限于軍隊(duì)中使用。除此之外，國內(nèi)外關(guān)于腺病毒的疫苗研究及臨床應(yīng)用都還在基礎(chǔ)研究階段。
　　 雖然腺病毒的疫苗研究還在起步，但是以腺病毒為載體的基因工程疫苗已經(jīng)被廣泛研究。腺病毒載體和其他病毒載體相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):病毒結(jié)構(gòu)和功

6、能背景清楚;可以攜帶10kb以內(nèi)的外源基因;感染范圍廣;結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不整合到宿主細(xì)胞基因組也不易發(fā)生突變等。最新的數(shù)據(jù)表明全球約有1/4的基因治療和疫苗載體的臨床試驗(yàn)應(yīng)用了Adv2和Adv5載體。但是強(qiáng)烈的宿主排斥反應(yīng)一直是腺病毒載體在臨床上應(yīng)用的阻礙，而且，近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，因?yàn)橄俨《臼荏wCAR在許多腫瘤細(xì)胞表面并不表達(dá)，導(dǎo)致病毒載體無法吸附細(xì)胞，對CAR受體依賴的2型和5型腺病毒載體可能并不適合腫瘤治療使用。人3型腺病毒的受體作用機(jī)制雖

7、仍未清楚，但目前研究表明大部分腫瘤細(xì)胞表面都有其受體的表達(dá)，因而Adv3將可能作為腫瘤治療的新型載體候選，也有些學(xué)者已經(jīng)在進(jìn)行4型，35型等其他血清型腺病毒載體相關(guān)的研究。
　　 本課題組自2007年開始腺病毒疫苗的研發(fā)工作，至今，我們的研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)圍繞腺病毒基因工程疫苗的研制做了大量相關(guān)研究，并取得階段性進(jìn)展。目前，我們已經(jīng)成功構(gòu)建了非復(fù)制型基因工程Adv3;置換Adv3和Adv7的六鄰體區(qū)域構(gòu)建新的重組腺病毒，并鑒定其免疫原

8、性也發(fā)生了改變;對3型和7型腺病毒中和表位的進(jìn)行了預(yù)測和鑒定，置換Adv3和Adv7上中和表位，構(gòu)建新的嵌合病毒，研究證明其在動物實(shí)驗(yàn)中可同時誘導(dǎo)抗人3型和7型腺病毒中和抗體;以3型腺病毒為載體，成功構(gòu)建了帶有腸道病毒EV71中和表位的重組3型腺病毒等，其可能為同時抗EV71和Adv3的雙價疫苗。
　　 本課題組在腺病毒疫苗研究中取得的成果都已經(jīng)發(fā)表，然而，當(dāng)疫苗應(yīng)用于臨床，則需要了解目標(biāo)人群中Adv中和抗體的預(yù)存情況，清楚了解

9、普通人群血清中是否存在中和抗體，中和抗體陽性率以及其分布特點(diǎn)，這些結(jié)果將指導(dǎo)我們選擇合適的免疫人群及最佳免疫時間，對疫苗的開發(fā)及使用具有指導(dǎo)意義。因此，本研究的第一部分主要對廣州健康人群體內(nèi)3型，4型和7型腺病毒中和抗體水平進(jìn)行了檢測和分析，了解腺病毒中和抗體分布特點(diǎn)及變化。
　　 本研究的第二部分則是在課題組前期對Adv3中和表位的預(yù)測及研究基礎(chǔ)上，通過制備和篩選Adv3的中和性單克隆抗體，以此為媒介，對3型腺病毒的中和表位進(jìn)

10、行鑒定研究。通過體外中和抗體和中和表位的特異性結(jié)合，確認(rèn)預(yù)測中和表位的有效序列。
　　 第一章普通人群血清中腺病毒的中和抗體分析
　　 本實(shí)驗(yàn)收集了2008年廣州市兒童醫(yī)院職工體檢血清標(biāo)本、廣州銀行醫(yī)院體檢血清標(biāo)本和門診非呼吸道患兒血清標(biāo)本共452份，通過微孔板血清中和試驗(yàn)檢測3型，4型和7型腺病毒中和抗體水平。將標(biāo)本按照年齡共分為7個組:0-6m組，7-12m組，1-3y組，3-7y組，7-20y組，20-40y組合4

11、0-60y組。先進(jìn)行病毒滴度測定和血清效價預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定微孔板血清中和試驗(yàn)的病毒工作濃度是100TCID50，血清的稀釋比例是1∶8。然后開始進(jìn)行血清標(biāo)本的中和試驗(yàn)，當(dāng)陽性對照、正常細(xì)胞對照，血清毒性對照全部成立時，進(jìn)行判定結(jié)果判定，以被檢血清孔出現(xiàn)100％ CPE判為陰性，50％以上細(xì)胞出現(xiàn)保護(hù)者為陽性。
　　 采用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)，通過R×C資料卡方檢驗(yàn)，普通人群腺病毒中和抗體平均分布具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。

12、從7-20y組開始，腺病毒中和抗體陽性率顯著上升。除了0-6m組人群，3型，4型和7型腺病毒中和抗體陽性率都隨年齡增加而增高。3型腺病毒中和抗體率最低的是6-12m組和1-3y組，之后，隨年齡增加，在20-40y組人群中和抗體陽性率已經(jīng)達(dá)到78％，在40-60y組中和抗體陽性率也穩(wěn)定在78％;4型腺病毒中和抗體率最低是在6-12m組，隨年齡增加而升高，在7-20y組人群中和抗體陽性率達(dá)到60％，20-40y組人群中和抗體陽性率保持穩(wěn)定，

13、但在40-60y組人群中和抗體陽性率又開始上升至82％;7型腺病毒中和抗體率最低的是1-3y組，陽性率僅5％，之后隨年齡增加而上升，直到40-60y組人群中和抗體陽性率高達(dá)76％。研究結(jié)果充分顯示了人群中和抗體水平的年齡依賴性，而且不同血清型的腺病毒中和抗體水平分布也有所不同。
　　 對0-1y嬰幼兒腺病毒中和抗體水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0-1m嬰兒群體的3型腺病毒中和抗體陽性率最高，達(dá)到58％，之后開始下降，到3-6m年齡組的時

14、陽性率最低，陽性率為13％，之后開始緩慢上升。7型腺病毒中和抗體水平變化趨勢和3型腺病毒相同，但是每組的陽性率都要低于3型腺病毒中和抗體水平，尤其是3-6m組，陽性中和抗體率為0。根據(jù)卡方分析，Adv3組x2=16.979，P＜0.05，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異，Adv7的P＜0.05，其抗體水平變化也有差異，而Adv4組P＞0.05，抗體變化無統(tǒng)計學(xué)差異。而4型腺病毒中和抗體陽性率變化和以上兩組都不同，它也是0-1m組最高，但其他3個年齡組

15、變化不大，都維持在10-13％之間，可能和其感染方式及流行特點(diǎn)有關(guān)。該組分析顯示母體抗體對0-6m嬰兒具有保護(hù)作用。
　　 不同血清型腺病毒感染后會誘發(fā)型特異型的中和抗體，因此，在人體內(nèi)可能會同時存在不同型的腺病毒中和抗體，我們對人群中不同型腺病毒中和抗體混合存在的情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:3種血清型病毒的中和抗體都不存在的人數(shù)比例在6-12m組和1-3y組最高，都有70％以上，之后，隨年齡增大而比例下降，尤其是從3-7y組到7-

16、20y組，比例急劇下降，從54％降至9％，而到40-60y組人群，抗體陽性比例為0，即檢測人群中任何人都可能已經(jīng)攜帶了1種或多種腺病毒中和抗體;只攜帶一種腺病毒中和抗體的人群比例最高的是0-6m組和7-20y組，0-6m組人群抗體陽性率為45％，7-20y組人群抗體陽性率為37％。攜帶兩種和三種腺病毒中和抗體人群比例則是隨年齡增加而增加，40-60y年齡組人群中，他們的中和抗體陽性率分別是42％和46％。這組研究揭示，每個人在一生中都可

17、能遭遇一次或者多次的腺病毒感染，腺病毒疫苗的使用可能減少每個人被腺病毒感染的幾率。
　　 對不同環(huán)境中人群的腺病毒中和抗體水平進(jìn)行分析，從數(shù)據(jù)來看，醫(yī)護(hù)職工不同型別的腺病毒中和抗體陽性率都要稍高于普通人群，但通過卡方檢驗(yàn)，三種腺病毒中和抗體的陽性率分別統(tǒng)計，他們的P＞0.05，說明不同腺病毒的兩種人群檢測結(jié)果都無顯著性差異。
　　 本章從不同角度對人群腺病毒中和抗體陽性水平進(jìn)行了分析和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺病毒中和抗體的陽性率

18、有明顯的年齡依賴性，隨著年齡增長，抗體攜帶陽性率也增高，6m-3y之間，不同型腺病毒的中和抗體陽性率都偏低，這段時間不但是腺病毒的易感時期，也可能是接種腺病毒疫苗的最佳時期。而且不同血清型的腺病毒中和抗體的流行分布也有不同，3型和7型腺病毒的流行趨勢較為接近，而4型腺病毒散發(fā)性更為明顯。腺病毒感染在人群中普遍存在，40-60y人群抗體攜帶的數(shù)據(jù)顯示，每個人都可能攜帶一種或多種腺病毒中和抗體。本次研究的結(jié)果將為腺病毒疫苗的開發(fā)及腺病毒基因

19、工程載體的研究都有一定的促進(jìn)作用。
　　 第二章3型腺病毒單克隆抗體的制備和初步鑒定
　　 本實(shí)驗(yàn)將增殖的3型腺病毒用蔗糖梯度密度離心方法進(jìn)行純化，然后免疫BALB/c小鼠，通過PEG使小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞融合，并使用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，用間接ELISA方法測定單克隆抗體的效價，結(jié)果獲得1株能穩(wěn)定傳代的雜交瘤細(xì)胞株1B6。然后對獲得的單克隆抗體1B6進(jìn)行免疫球蛋白亞型，1B6MAb鑒定IgG1亞型，輕鏈

20、為κ鏈。然后制備腹水，最后用飽和硫酸銨-辛酸沉淀法對單克隆抗體腹水進(jìn)行純化，獲得高效價的1B6 MAb。根據(jù)ELISA和Westernblotting結(jié)果顯示，1B6MAb與Adv3病毒粒子和原核表達(dá)的六鄰體蛋白有良好的反應(yīng)性和特異性，同時也證明1B6MAb可以識別六鄰體的線性表位。并且通過細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測，也能直觀看出1B6抗體只和Adv3腺病毒感染的細(xì)胞有高度特異反應(yīng)性的結(jié)合，1B6MAb對病毒蛋白表位的天然狀態(tài)也能識別，都具有反

21、應(yīng)性，而且抗體靈敏度高，效價能達(dá)到105以上。
　　 通過本次實(shí)驗(yàn)，我們獲得了一株能夠穩(wěn)定傳代的雜交瘤細(xì)胞株，1B6MAb既能識別原核表達(dá)的六鄰體蛋白，也能識別天然病毒，很可能是一株針對六鄰體蛋白線性表位的多肽，而這個表位是否具有中和作用，還需要進(jìn)一步證實(shí)。
　　 第三章單克隆抗體1B6對3型腺病毒中和表位的鑒定和分析
　　 首先，復(fù)蘇并增殖Ad3EGF和A7HAd3egf兩株基因工程構(gòu)建病毒，Ad3EGF病毒載

22、體是將EGFP蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)病毒載體，使其帶有EGFP標(biāo)記，易于被檢測。而A7HAd3egf病毒則是前期同事將7型腺病毒的六鄰體蛋白取代3型腺病毒的六鄰體蛋白而形成的基因工程構(gòu)建病毒，該病毒已經(jīng)被從分子和免疫學(xué)角度證實(shí)其合成表達(dá)的六鄰體蛋白確實(shí)是7型腺病毒六鄰體蛋白。
　　 我們將1B6MAb與這兩株帶有綠色熒光蛋白的基因工程構(gòu)建病毒孵育后，進(jìn)行體外中和試驗(yàn)，通過熒光測定法，檢測抗體和病毒中和后，細(xì)胞受感染的情況。采用SPSS兩獨(dú)立

23、樣本t檢驗(yàn)分析，每組t檢驗(yàn)比較的P＜0.05，即每組數(shù)據(jù)都有顯著差異，即表明和對照試驗(yàn)相比，Ad3EGF病毒感染能被1B6抗體保護(hù)。從熒光檢測的結(jié)果來看，在1∶64抗體稀釋作用的時候，病毒的復(fù)制未受到影響，Ad3EGF和A7HAd3egf病毒熒光檢測相對比值都在70％以上，而A7HAd3egf熒光值更是高達(dá)99％。而之后，抗體稀釋到1∶32時，Ad3EGF的復(fù)制開始受到1B6抗體的抑制，熒光值下降到40％，在1∶8抗體稀釋度時候，相對熒

24、光值已經(jīng)在小于20％，病毒復(fù)制明顯被抑制，Ad3EGF熒光值隨抗體滴度的增加而明顯下降。而病毒A7HAd3egf熒光值則一直穩(wěn)定在80-100％之間，它的復(fù)制幾乎未受到抗體中和作用限制。中和試驗(yàn)的結(jié)果可以明顯看出，1B6抗體具有中和作用，而且特異針對3型腺病毒的六鄰體蛋白。
　　 然后，我們通過比對同源性較高的Adv3-gz01和Adv7-gz8腺病毒的六鄰體氨基酸序列，選擇了6個變異區(qū)段進(jìn)行原核表達(dá)。間接ELISA結(jié)果可以看出

25、，1B6MAb對R7和R7s都具有高特異性，但是R7s的特異性比R7稍低，而對其他變異區(qū)肽段都呈陰性反應(yīng)。推測可能R7s缺少了幾個氨基酸殘基，從而親和力比R7弱，但這個推測還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
　　 為了對鑒定的表位進(jìn)行確證，我們又設(shè)計了競爭抑制實(shí)驗(yàn)。ELISA實(shí)驗(yàn)采用3×4析因分析結(jié)果，三因素的P＜0.05，說明稀釋濃度和競爭抗原不同，所檢測的OD值都有差異，而且稀釋濃度和競爭抗原兩因素間存在交互作用，即蛋白濃度的高低也影

26、響了其競爭能力的高低。R7片段上的表位可以完全封閉MAb1B6的對位，令單克隆抗體失去對全長衣殼蛋白的識別能力，R7s片段封閉功能較弱，只能部分封閉單克隆抗體的對位，而作為對照的R1蛋白，沒有封閉能力。
　　 最后，我們還把本課題組之前構(gòu)造的各種腺病毒基因工程載體，都與MAb1B6抗體進(jìn)行了特異性驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只要是含有3型腺病毒六鄰體R7序列的重組病毒都能夠被識別，而其他R7序列突變的六鄰體蛋白的重組腺病毒則不能被識別。該實(shí)

27、驗(yàn)不但再次證實(shí)了MAb1B6對3型腺病毒六鄰體蛋白的特異性。而且，由于這些腺病毒基因工程載體都保持了表位的天然結(jié)構(gòu)，再次證明1B6抗體可以識別天然表位，也能識別線性表位，而我們所鑒定的R7表位應(yīng)該是一個連續(xù)性的線性的天然表位。
　　 本章不但通過中和試驗(yàn)驗(yàn)證了1B6MAb對3型腺病毒六鄰體的中和作用，而且能專一識別六鄰體上R7表位，也通過競爭ELISA試驗(yàn)等證實(shí)了六鄰體上R7表位是一個連續(xù)性線性的天然表位。
　　 結(jié)論:

28、
　　 一、本課題對普通人群血清中腺病毒中和抗體水平從不同角度進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，成年人群血清中70％以上都帶有一種以上腺病毒中和抗體，尤其是40-60y年齡組，人群中和抗體陽性率為100％。6m以前的嬰兒，50％以上都受到母體抗體的保護(hù)，而6m-3y年齡組人群抗體陽性率最低，他們是腺病毒感染的易感人群，而該年齡段也是疫苗接種的最佳時期。
　　 二、本課題獲得了一株能高特異性、高靈敏性的能識別連續(xù)的線性的天然表位的中和