人乳頭瘤病毒L1廣譜中和表位的鑒定和結(jié)構(gòu)預(yù)測定位.pdf

1、高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的持續(xù)感染被認(rèn)為是誘發(fā)女性宮頸癌的主要因素。宮頸癌在危害婦女健康的惡性腫瘤疾病中居第二位。世界范圍內(nèi)，宮頸癌每年大約有50萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)約20萬;中國每年約有13萬人罹患宮頸癌。與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)的高危型HPV有15個(gè)型別以上，其中，HPV16與18約占70％。目前，HPV疫苗被認(rèn)為是防控包括宮頸癌在內(nèi)的宮頸疾病的最有效手段，而現(xiàn)有的HPV疫苗多因成本與制造工

2、藝?yán)щy等因素，僅能覆蓋HPV16與18兩個(gè)型別，無法滿足需要。因此，有必要開發(fā)一種覆蓋型別更廣，保護(hù)率更高的HPV疫苗。擴(kuò)大疫苗保護(hù)型別、L2疫苗、嵌合顆粒疫苗成為了研究多型別保護(hù)的主要方向，而廣譜中和單抗及表位的研究是其中最核心的研究內(nèi)容。
　　本研究利用多種型別HPVL1 VLP進(jìn)行了免疫，通過免疫方案及篩選檢測方法的摸索，確定了一套成熟的HPV廣譜中和單抗的篩選方法:使用不同型別HPVL1 VLP輪流免疫，并使用鋁佐劑，免疫

3、劑量為1-10μg/只/次，兩次免疫間隔時(shí)間為三周。在免疫后26周后進(jìn)行篩選，篩選時(shí)采用ELISA檢測與假病毒-細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)檢測相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法。經(jīng)過該方法進(jìn)行免疫及篩選，得到了三株具有能夠中和2種型別以上HPV假病毒的中和單抗，分別為13A10、12B9及4H4。
　　本研究進(jìn)一步對(duì)三株廣譜中和單抗進(jìn)行了系統(tǒng)的性質(zhì)鑒定。首先，通過ELISA間接法檢測發(fā)現(xiàn)∶13A10與A9類的HPV58/16/31/33/52 VLP均能反應(yīng)，其

4、對(duì)HPV58五聚體的結(jié)合能力較VLP低約500倍;12B9能與HPV16/31/33/58 VLP反應(yīng);4H4能與HPV16/31/33 VLP反應(yīng)。其次，使用Western-bloting檢測發(fā)現(xiàn)三株廣譜中和單抗都為針對(duì)構(gòu)象表位的單抗;然后，通過多型別假病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測廣譜中和單抗的中和滴度，13A10能中和HPV16/58/31/33四種型別假病毒，其中針對(duì)HPV16與HPV58的中和滴度高達(dá)105，與型特異抗體的中和滴度相當(dāng);12

5、B9能中和HPV33/58兩型假病毒;4H4能中和HPV16/31/33三型假病毒，中和滴度在103.2至105之間;通過單抗阻斷兔多抗血清、病人血清、疫苗注射者血清及型單抗多種阻斷實(shí)驗(yàn)，其中13A10對(duì)單份的HPV58血清的阻斷率都在80％以上，并且能夠阻斷50％以上能與HPV58反應(yīng)的血清，可以確定13A10為HPV58優(yōu)勢中和單抗;12B9能阻斷絕大多數(shù)針對(duì)HPV33的單抗，且阻斷率較高;但12B9及4H4對(duì)血清阻斷效果較差，因此

6、確定這兩株單抗為非優(yōu)勢中和抗體。最后，本研究還通過生物傳感器分析了廣譜中和單抗與抗原的親和力，其中13A10與HPV58L1 VLP親和力高到10-10mol/L，與型特異性單抗與抗原親和力相當(dāng)。
　　由于13A10是一株能夠中和4種HPV假病毒，具有較高的中和滴度與親和力，而且為HPV58的優(yōu)勢單抗。因此，進(jìn)一步對(duì)其表位進(jìn)行了定位，首先，通過GFC-HPLC與AUC的實(shí)驗(yàn)方法，確定了13A10與HPV VLP結(jié)合的化學(xué)計(jì)量摩爾比

7、為2.5∶1(n∶n);然后通過分子模擬的方法，對(duì)HPV58五聚體和廣譜中和單抗13A10結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建和分子對(duì)接，預(yù)測了13A10與HPV16及HPV58的結(jié)合表位:為55-59位aa、442-433位aa、177及348位aa;并通過HPV16、HPV6L1 loop互換的18種嵌合顆粒驗(yàn)證了分子對(duì)接的結(jié)果，確定了Ser343、Leu344、Cys345、Ala346、Ile348、Set349、Thr350中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸為