MSTN納米抗體的篩選和功能驗證.pdf

1、本研究以抑制綿羊肌肉生長抑制素（MSTN）的功能為出發(fā)點，通過制備MSTN納米抗體，探究一條有效促進動物肌肉生長的新途徑。利用噬菌體展示技術表達綿羊 MSTN納米抗體基因文庫，經過四輪親和淘選(Panning)獲得 MSTN高特異性的納米抗體片段，利用大腸桿菌表達 MSTN納米抗體并分離純化，在細胞水平和小白鼠動物試驗中驗證 MSTN納米抗體對肌肉生長作用的影響。主要研究方法與結果如下：
　　1、綿羊 MSTN的誘導表達，確定 E

2、LISA包被抗原用量。利用 IPTG在大腸桿菌中誘導表達 MSTN成熟肽蛋白并純化，通過 ELISA和 Western blot方法檢測抗原反應原性，優(yōu)化親和淘選包被抗原蛋白的濃度。
　　2、綿羊 MSTN納米抗體的淘選和鑒定。擴繁 M13K07噬菌體侵染原始文庫，構建噬菌體展示抗體文庫，噬菌體文庫容經滴度測定達到1.8×1012 pfu/mL。利用重組 MSTN蛋白抗原對噬菌體抗體庫進行富集、篩選，經過4輪親和淘選，獲得了一株親

3、和力高、特異性強的陽性克隆，測序后經 BLAST比對分析證實該克隆序列為駱駝單域重鏈抗體序列。
　　3、 MSTN納米抗體在大腸桿菌中誘導表達與鑒定。利用 PCR克隆出目的抗體基因序列，構建兩種原核表達載體，轉化大腸桿菌后經 IPTG誘導表達，表達產物經 HIS鎳柱純化重組抗體，經 ELISA和 Western blot驗證其與 MSTN抗原結合的親和活性和特異性。
　　4、 MSTN納米抗體對小白鼠生長效果研究。通過 MT

4、T細胞計數法驗證其對成肌細胞 C2C12無毒性作用。實驗分組對小白鼠肌肉定量注射納米抗體，比較各試驗組小白鼠體重增長變化，對試驗小白鼠肌肉組織切片和免疫熒光觀察其肌肉形態(tài)學變化和 MSTN蛋白表達量變化情況。結果表明納米抗體可以明顯促進小白鼠的體重增長，注射納米抗體的小白鼠肌纖維橫截面積高于未注射納米抗體組和對照組，表明 MSTN納米抗體對肌肉生長具有明顯促進作用。綜上所述，本研究通過四輪親和淘選成功篩選到駝源綿羊 MSTN納米抗體，并