體內篩選和功能驗證胰腺癌肺轉移的關鍵基因.pdf

1、目的：利用混合多克隆細胞亞群裸鼠體內實驗和基因組PCR的方法進行篩選和驗證具有肺轉移能力的細胞亞群、相關候選基因以及遺傳通路，為進一步研究惡性腫瘤轉移的分子機理打下基礎，為胰腺癌的臨床診斷、治療以及預防提供新的策略和靶點。
　　 方法：分別培養(yǎng)實驗室前期得到的45個胰腺癌肺轉移細胞克隆，待細胞生長至對數(shù)生長期時，取1×105個細胞/克隆，將45個細胞克隆混合為多克隆細胞亞群?；旌霞毎麛U增培養(yǎng)后，在第一輪的動物篩選試驗中，通過尾靜

2、脈的注射方式接種混合的多克隆細胞亞群到裸鼠體內，1×106個細胞/只，裸鼠分為通過飲水給予強力霉素(Doxycycline，Dox)實驗組和普通飲水對照組，每組8只。待裸鼠出現(xiàn)瀕死體征時，取其肺組織（含轉移灶）原代培養(yǎng)肺轉移細胞亞群，提取其基因組DNA進行PCR分析，比較兩組裸鼠特異基因檢出率。
　　 在第二輪的動物篩選試驗中，分別通過尾靜脈和腹腔注射2種方式接種裸鼠，1×106個細胞/只，每種接種方式又分為給予強力霉素實驗組和

3、普通飲水對照組，每組8只，余操作(原代培養(yǎng)、基因組PCR)同第一輪動物篩選實驗。
　　 結果：本實驗通過兩輪動物體內篩選具有高轉移特性的胰腺癌細胞株，經原代培養(yǎng)成功得到46個具有肺轉移能力的胰腺癌細胞亞群。第一輪經尾靜脈接種瘤細胞的裸鼠體內篩選和基因組PCR結果顯示：在沒有給予強力霉素的8只裸鼠中有5只檢測到SQSTM1基因，檢出率為62.5％(5/8)；而在給予強力霉素的8只裸鼠中只有3只檢測到SQSTM1基因，檢出率為37.

4、5%(3/8)。給予強力霉素組裸鼠平均存活時間為92天；普通飲水對照組裸鼠平均存活時間為75天。
　　 第二輪經尾靜脈接種瘤細胞的裸鼠體內篩選和基因組PCR結果顯示：在沒有給予強力霉素的8只裸鼠中有6只檢測到SQSTM1基因，檢出率為75%(6/8)；而在給予強力霉素的8只裸鼠中只有3只檢測到SQSTM1基因，檢出率為37.5%(3/8)。給予強力霉素組裸鼠平均存活時間為86天，肺臟組織肉眼未見明顯轉移灶；普通飲水對照組裸鼠存活

5、時間為74天，肺臟組織肉眼可見明顯轉移灶。
　　 第二輪經腹腔接種瘤細胞的裸鼠體內篩選和基因組PCR結果顯示：62.5%(5/8)沒有給予強力霉素的裸鼠中肺轉移檢測到SQSTM1基因，而在給予強力霉素的裸鼠中只有33.34%(2/6)的肺轉移細胞亞群能夠檢測到SQSTM1基因。給予強力霉素組裸鼠平均存活時間為87天；普通飲水對照組裸鼠存活時間為76天。
　　 兩輪裸鼠體內篩選和基因組PCR分析其他候選基因，包括Sema4

6、b，Ube2k和Gna13，均未檢測到表達。表明強力霉素介導的SQSTM1基因在胰腺癌肺轉移過程中其關鍵作用。Western-Blot、Q-PCR顯示強力霉素能夠調控SQSTM1基因的表達和關閉。
　　 結論：多克隆混合同步篩選可驗證得到胰腺癌肺轉移細胞亞群和與其關聯(lián)的基因。SQSTM1基因在胰腺癌肺轉移過程中起關鍵作用；在“全基因組隨機基因調控技術平臺”的基礎上，通過給予或不給予強力霉素能夠實現(xiàn)SQSTM1基因表達的人為控制。