淇河鯽MSTN基因相關(guān)microRNA的篩選與功能研究.pdf

1、淇河鯽(Carassius auratus in Qihe River)屬于銀鯽的一種，天然雌核發(fā)育，脊背寬厚是區(qū)別于其它銀鯽魚最主要的特征。目前在淇河鯽育種、疾病免疫、飼料營(yíng)養(yǎng)等方面已開展較多研究，但是淇河鯽生長(zhǎng)性狀相關(guān)的基礎(chǔ)研究還相對(duì)薄弱，其脊背寬厚的生長(zhǎng)機(jī)制尚不清楚。肌肉生長(zhǎng)抑制素基因(myostatin，MSTN)是一種負(fù)調(diào)控因子，它最主要功能是調(diào)節(jié)動(dòng)物的骨骼肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。microRNAs(miRNAs)是一類非編碼單鏈小RN

2、As，近年來它的作用和功能越來越多地被發(fā)掘。miRNAs技術(shù)的發(fā)展為探索淇河鯽脊背寬厚這一問題開辟了一條新的途徑。提取淇河鯽總RNA，克隆，得到淇河鯽MSTN3'UTR序列。根據(jù)MSTN3'UTR序列通過TargetScans等軟件預(yù)測(cè)出相關(guān)miRNAs，再利用RNAhybrid軟件進(jìn)行驗(yàn)證，最終選取miR-181a和miR-181b作為候選miRNAs。以肌肉總DNA為模板，獲得pri-miR-181a和pri-miR-181b全長(zhǎng)。

3、構(gòu)建真核表達(dá)載體和miRNA慢病毒載體，通過雙熒光檢測(cè)和熒光原位雜交技術(shù)分別從分子水平和組織細(xì)胞定位方面確定MSTN和miR-181a、miR-181b之間的相互關(guān)系。采用qRT-PCR分析miR-181a、miR-181b和MSTN在淇河鯽腦、肌肉和心臟等8個(gè)組織的表達(dá)情況以及miR-181a、miR-181b和MSTN在胚胎發(fā)育及其在前期生長(zhǎng)不同階段的表達(dá)情況。由此進(jìn)一步揭示淇河鯽肌肉生長(zhǎng)相關(guān)基因間的多層次網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式，探索淇河鯽肌

4、肉生長(zhǎng)機(jī)制。
　　1、淇河鯽MSTN基因3'UTR的克隆
　　提取總RNA，克隆得到MSTN基因3'UTR，拼接后獲得3'UTR長(zhǎng)度是865bp。在NCBI中，經(jīng)過Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，得到片段與鯉形目魚類相似度較高，尤其與南亞野鯪(Labeo rohita)(91％，KR052242.1)和鯉魚(Cyprinus carpio)(92％，LN590705.1)，淇河鯽(Carassius auratus in Qihe ri

5、ver)(88％，KC851952.1)同源性最高。
　　2、淇河鯽MSTN基因相關(guān)miRNAs的預(yù)測(cè)、驗(yàn)證及克隆
　　根據(jù)MSTN基因3'UTR序列結(jié)果，利用RegRNA、Pictar、TargetScan、miRWalk、miRDB等軟件，，預(yù)測(cè)相關(guān)miRNAs，進(jìn)一步用RNAhybrid軟件驗(yàn)證，選取可能與MSTN基因相關(guān)的miR-181a和miR-181b作為候選miRNAs。從淇河鯽肌肉中提取總DNA，克隆pri-

6、miR-181a和pri-miR-181b。
　　3、真核載體的構(gòu)建及雙熒光檢測(cè)
　　本實(shí)驗(yàn)中把MSTN3'UTR序列和加突變位點(diǎn)的3'UTR序列雙酶切，連接至pmirGLO載體;pri-miR-181a/b雙酶切，連接至Lenti H1載體，分別構(gòu)建真核表達(dá)載體和miRNAs慢病毒載體。構(gòu)建的兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，雙熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-181a/b對(duì)MSTN基因均可能有一定的抑制作用，此外還發(fā)現(xiàn)miR-181a/

7、b與MSTN還可能存在其他的結(jié)合位點(diǎn)共同作用調(diào)節(jié)MSTN基因的表達(dá)。
　　4、MSTN和miR-181a在肌肉組織中的表達(dá)定位
　　取淇河鯽背部和腹部肌肉，制成石蠟切片，合成探針，檢測(cè)MSTN基因和miR-181a在肌肉組織中的表達(dá)位置。結(jié)果表明，MSTN在肌纖維中表達(dá)量較高;miR-181a在肌漿膜中表達(dá)量較高，并且在結(jié)締組織中也有表達(dá)。此外還發(fā)現(xiàn)miR-181a在背部肌肉的表達(dá)量低于腹部，在腹部肌纖維中MSTN表達(dá)量顯著

8、高于背部，因此推測(cè)在背部肌肉中miR-181a對(duì)MSTN的抑制作用可能沒有腹部明顯。
　　5、淇河鯽MSTN基因及相關(guān)miR-181a/b特異性表達(dá)
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，淇河鯽MSTN基因在不同組織表達(dá)量存在顯著性差異，其中心肌和腦中最高，肌肉其次，腎臟最低;胚胎發(fā)育及前期生長(zhǎng)不同階段，MSTN基因在原腸胚以前，出生20d表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期。miR-181a在肌肉和鰓的表達(dá)豐度顯著高于其他組織，在原腸胚以前和孵化