大腸癌相關(guān)microRNA的篩選及mir-27b的功能研究.pdf

1、研究背景：
　　大腸癌嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，為發(fā)病率最高的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其常由于治療抵抗與轉(zhuǎn)移而致死。目前在大腸癌組織中分選出一群CD133、CD44、CD166、ALDH1等標(biāo)記的細(xì)胞亞群，其雖在腫瘤組織中只占很小的比例，但具有很強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能，稱(chēng)之為大腸癌腫瘤干細(xì)胞(ColorectalCancerStemCells，CCSCs)。
　　miRNA為長(zhǎng)度約18-25個(gè)堿基的單鏈非編碼RNA，可在基因轉(zhuǎn)錄后

2、階段促使靶基因mRNA降解/或抑制靶基因mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程。在胚胎發(fā)育階段中miRNA起著重要作用，疾病情況下尤其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中其同樣發(fā)揮著關(guān)鍵的生物學(xué)作用。miRNA可起到促癌或抑癌的功能，miR-155可導(dǎo)致腫瘤信號(hào)通路的激活，let-7家族則可抑制腫瘤信號(hào)通路，miR-200家族等通過(guò)調(diào)控EMT過(guò)程而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。miR-27b的編碼基因位于9號(hào)染色體，研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中其可通過(guò)作用PPARγ而發(fā)揮抑

3、癌功能。在生理情況下，miR-27b則可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)而促進(jìn)血管形成。
　　腫瘤干細(xì)胞在腫瘤組織中處于核心位置，具有明顯區(qū)別于普通腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性，其與普通腫瘤細(xì)胞之間分子水平的差異亦可為腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵分子。大腸癌腫瘤干細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞間差異miRNA的研究不僅可進(jìn)一步探究大腸癌發(fā)生發(fā)展中表觀遺傳學(xué)調(diào)控的分子機(jī)制，也可為大腸癌的基因治療提供新的靶點(diǎn)和思路。
　　研究方法：
　　本課題利用原代大腸

4、癌肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞及ATCC標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，miRNA表達(dá)差異芯片篩選出多個(gè)差異的miRNA。結(jié)合課題組前期研究工作而對(duì)miR-27b進(jìn)行深入研究，定量PCR檢測(cè)配對(duì)的大腸癌組織及癌旁正常組織中miR-27b的表達(dá)水平。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)大腸癌的細(xì)胞增殖、克隆形成及動(dòng)物致瘤能力的影響，瘤內(nèi)注射膽固醇修飾的miR-27b后HE染色、免疫熒光檢測(cè)以評(píng)價(jià)其腫瘤治療能力。結(jié)合生物信息學(xué)分析、熒光素雙報(bào)告基因系統(tǒng)、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)等鑒定miR-27b的功能

5、靶基因，并且甲基化特異性PCR等實(shí)驗(yàn)初步探討了miR-27b的上游調(diào)控機(jī)制。本課題豐富了大腸癌研究的內(nèi)容，不僅對(duì)大腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有所闡明而且為基因治療提供了合適的靶點(diǎn)。
　　研究結(jié)果：
　　1.大腸癌腫瘤干細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞具有明顯差異的miRNA表達(dá)譜。
　　前期大腸癌研究的工作基礎(chǔ)證實(shí)，CD133+細(xì)胞亞群表現(xiàn)明顯的腫瘤干細(xì)胞特性。在CD133+和CD133-細(xì)胞亞群中miRNA表達(dá)譜具有明顯差異，對(duì)芯片結(jié)

6、果中重復(fù)改變的miR-27b進(jìn)行深入研究。在80對(duì)石蠟包埋的大腸癌組織及癌旁正常組織的檢測(cè)中，miR-27b在60％的大腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，僅在15％的大腸癌中表達(dá)上調(diào)，因此miR-27b在大腸癌中可能起到抑癌基因的作用。
　　2.miR-27b能抑制大腸癌生長(zhǎng)及血管形成。
　　慢病毒感染成功建立miR-27b大腸癌細(xì)胞高表達(dá)/抑制的穩(wěn)定細(xì)胞以驗(yàn)證其生物學(xué)功能。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果示miR-27b能明顯抑制大腸癌細(xì)胞增殖及克隆形成能

7、力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示miR-27b能顯著抑制大腸癌的致瘤能力，老鼠負(fù)瘤模型上的腫瘤治療實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-27b具有抗腫瘤作用。所有結(jié)果證明在大腸癌中miR-27b表現(xiàn)抑癌基因的功能，提示其可成為潛在的抗癌藥物。
　　3.在大腸癌中VEGFC是miR-27b的功能靶基因。
　　miRNA是通過(guò)介導(dǎo)基因沉默而起功能的，因此，miRNA研究的要點(diǎn)在于其下游功能靶基因的篩選鑒定。我們證實(shí)VEGFCmRNA3'端非翻譯區(qū)包含miR-27b

8、的保守結(jié)合位點(diǎn)，熒光素雙報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)示miR-27b可引起miRNA靶基因報(bào)告載體熒光強(qiáng)度的明顯改變。且大腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-27b后，無(wú)論細(xì)胞內(nèi)還是培養(yǎng)上清中，VEGFC的蛋白表達(dá)都出現(xiàn)下調(diào)。在大腸癌細(xì)胞中抑制VEGFC表達(dá)，其惡性生物學(xué)表型可被明顯逆轉(zhuǎn)，證實(shí)VEGFC不僅為miR-27b的靶基因，更為其功能靶基因。
　　4.啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化可抑制miR-27b的表達(dá)。
　　遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)可能涉及miR-2

9、7b的調(diào)控。甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC（5AZA）處理大腸癌細(xì)胞后miR-27b水平明顯上調(diào)。通過(guò)熒光素雙報(bào)告基因系統(tǒng)確認(rèn)其位于9號(hào)染色體的啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)一步的甲基化特異性PCR示大腸癌細(xì)胞中miR-27b的啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)高甲基化，提示DNA高甲基化與其表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，并且，生物信息學(xué)分析出miR-27b可能為轉(zhuǎn)錄因子Evi-1及c-Rel等所調(diào)控。
　　研究結(jié)論：
　　miR-27b能顯著抑制大腸癌細(xì)胞的自我更新及致瘤