大腸癌肝轉(zhuǎn)移相關的間質(zhì)差異表達基因的篩選.pdf

1、目的：大腸癌肝轉(zhuǎn)移在全世界有著很高的發(fā)病率和病死率。目前越來越多的研究關注間質(zhì)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，間質(zhì)中出現(xiàn)的一些分子標志物對大腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期預測和指導靶向治療有著重要的作用，對大腸癌間質(zhì)分子標志物的研究，能更準確的預測大腸癌肝轉(zhuǎn)移，并為實現(xiàn)最佳的靶向治療奠定基礎。激光捕獲顯微切割和基因芯片兩種新興技術已成為腫瘤研究的重要手段。前者能在顯微鏡直視下通過激光捕獲和顯微切割從異質(zhì)性組織中得到目的細胞或細胞群，保證了組織的同質(zhì)性；后

2、者可同時高效率檢測成千上萬個基因，是篩選差異表達基因有力的工具。
　　本研究結合以上兩種技術，首先用激光捕獲顯微切割技術純化大腸癌伴或不伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)組織，然后采用Agilent Human4*44K2.0基因芯片構建大腸癌肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)的基因表達譜，以不伴肝轉(zhuǎn)移的大腸癌癌灶間質(zhì)為對照，采用多種生物信息學方法篩選大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)相關基因。
　　方法：收集大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶各4例，利用激光捕獲微切

3、割技術分離出間質(zhì)組織，提取間質(zhì)組織的總RNA，利用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，對質(zhì)檢合格的 RNA行線性擴增及Cy3單色熒光法標記染色后，采用Agilent Nanodrop ND-1000鑒定cRNA產(chǎn)量和純度及評估其熒光標記效率，對質(zhì)檢合格的cRNA，在適當條件下與Agilent Human4*44K2.0基因芯片進行雜交，芯片經(jīng)過洗滌和掃描后，以GeneSpring GX v11.51軟件對Cy3進行Normalize標準化

4、處理，進一步進行計算機軟件分析，最后得到篩選結果。
　　利用qRT-PCR對顯著上調(diào)及下調(diào)的前2位基因進行驗證。
　　結果：依fold change實驗組（大腸癌肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)組織）/對照組（無轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)組織）>2.0或<0.5的數(shù)據(jù)項，在4例新鮮標本的芯片雜交檢測中共篩選出1948條基因發(fā)生差異表達，其中上調(diào)的有1266條，下調(diào)的有682條，將這些基因按 GO（gene ontology）分子功能（Molecul

5、ar function）進行分類，發(fā)現(xiàn)這些差異表達基因與細胞分化、酶活性調(diào)節(jié)，信號轉(zhuǎn)導及基因轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)等有關。按Pathway分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與細胞外基質(zhì)受體相互作用、局部粘附、細胞粘附分子、抗原過程和呈遞、細胞因子間相互作用、TGF-β信號通路等通路。
　　RT-PCR驗證4條基因，顯示其表達方向與芯片檢測一致，符合預期結果。
　　結論：1.結合激光捕獲顯微切割和基因芯片兩個技術成功構建大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)的相