人大腸癌HT-29細(xì)胞系Livin基因相關(guān)miRNAs的篩選.pdf

1、目的:
　　1、探討siRNA抑制Livin基因表達(dá)對(duì)人大腸癌HT-29細(xì)胞系miRNA表達(dá)譜的影響。
　　2、結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,篩選出Livin基因的相關(guān)miRNAs。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)分為三組,轉(zhuǎn)染Livin-siRNA組為實(shí)驗(yàn)組,轉(zhuǎn)染無(wú)義siRNA組為陰性對(duì)照組,轉(zhuǎn)染空載組為空白對(duì)照組。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染48h后,采用實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)3組細(xì)胞Livin mRNA的

2、表達(dá)變化。
　　2、采用miRNA芯片(miRNA microarray)技術(shù)檢測(cè)Livin-siRNA實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組HT-29細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs。
　　3、采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)Livin基因相關(guān)的miRNAs,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析進(jìn)一步篩選出Livin基因的相關(guān)miRNAs。
　　3、采用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNAs分子。
　　結(jié)果:
　　1、Lipo2000轉(zhuǎn)染后48h,Livi

3、n-siRNA實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組HT-29細(xì)胞中Livin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.365±0.072,1.043±0.027,1。結(jié)果表明,Livin-siRNA實(shí)驗(yàn)組中Livin mRNA的表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05),而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中Livin mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　2、miRNA芯片結(jié)果顯示,Livin基因表達(dá)下調(diào)后,miRNA表達(dá)譜發(fā)生明

4、顯變化,共有117條miRNAs呈差異表達(dá)。與陰性對(duì)照組相比,Livin-siRNA實(shí)驗(yàn)組中有71條miRNAs表達(dá)水平上調(diào),46條miRNAs表達(dá)水平下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。
　　3、生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有60條Livin基因相關(guān)的miRNAs,結(jié)合miRNA芯片結(jié)果篩選出以下7條符合條件的miRNAs,其中hsa-miR-486-3p、hsa-miR-4688、hsa-miR-3918、hsa-miR

5、-762、hsa-miR-3620-5p表達(dá)上調(diào),而hsa-miR-3135b、hsa-miR-148b-3p表達(dá)下調(diào)。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762、hsa-miR-148b-3p與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此我們進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
　　4、Lipo2000轉(zhuǎn)染后48h,Livin-siRNA實(shí)驗(yàn)組HT-29細(xì)胞hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762、hsa-m

6、iR-148b-3p mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.254±0.272,2.484±0.337,0.645±0.100,陰性對(duì)照組hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762、hsa-miR-148b-3p mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.882±0.067,0.842±0.080,1.083±0.029,空白對(duì)照組hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762、hsa-miR-148b-3p mRNA的相對(duì)表達(dá)量均為1。L

7、ivin基因表達(dá)抑制后, hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762 mRNA的表達(dá)水平升高(P<0.05),而hsa-miR-148b-3p mRNA的表達(dá)水平下降(P<0.05),陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA干擾能有效抑制人大腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞中的Livin基因表達(dá)。
　　2、Livin基因表達(dá)抑制后,HT-29細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)