RNA干擾HER-2基因?qū)Υ竽c癌HT-29細(xì)胞影響的實驗研究.pdf

1、目前，大腸癌的發(fā)病機制同其它腫瘤一樣，癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因、生長因子及受體的異常表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)紊亂被認(rèn)為與大腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。表皮生長因子受體，是目前最受注目的腫瘤治療藥物的靶位。大量研究表明，表皮生長因子受體-2(epidermalgrowthfactoreceptor，HER-2)的酪氨酸激酶區(qū)域是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移和凋亡信號通路的重要部分。表皮生長因子EGF與受體HER-2的結(jié)合導(dǎo)致受體

2、的二聚體化和胞內(nèi)段磷酸化，進而引發(fā)一系列的級聯(lián)放大反應(yīng)，從而調(diào)控和傳遞大腸癌的生物學(xué)行為的信號。研究發(fā)現(xiàn)HER-2在人大腸癌組織中過表達(dá)，且其表達(dá)水平與預(yù)后的惡性程度呈正相關(guān)，HER-2的抑制劑有望被開發(fā)成為治療大腸癌的新藥。 RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(PTGS)，dsRNA經(jīng)RNA沉默復(fù)合體(RISC)降解成21-23nt的小片段(siRNA)，并以其為模板，特定位點、特定間隔

3、降解與之序列互補的mRNA，目前已成功用于基因功能和信號傳遞系統(tǒng)上下游分子相互關(guān)系的研究。本研究擬通過采用RNAi技術(shù)，探討利用體外合成shRNA和構(gòu)建質(zhì)粒載體的方法是否能有效沉默大腸癌細(xì)胞HER-2基因表達(dá)，阻斷HER-2所介導(dǎo)的惡性生物學(xué)行為，從而為大腸癌的基因治療提供新策略。 目的: 探討采用RNAi技術(shù)是否能有效抑制大腸癌HT-29細(xì)胞株HER-2表達(dá)，以及HER-2基因表達(dá)抑制后，大腸癌HT-29細(xì)胞生物學(xué)特性

4、的改變，以期為腫瘤治療提供新的理論依據(jù)和藥物靶點。 材料與方法: 體外合成短發(fā)夾狀shRNA-HER-2單鏈，并通過退火、回收、質(zhì)粒酶切、連接、轉(zhuǎn)化、挑克隆、提質(zhì)粒、測序等步驟，構(gòu)建和鑒定重組質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA-HER-2，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞株。用western-blot法檢測shRNA對HER-2蛋白表達(dá)變化情況；用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色分析檢測細(xì)胞體外增殖率情況；通過DAP

5、I染色觀察干擾后的細(xì)胞凋亡情況；通過原位末端標(biāo)記TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果: 成功構(gòu)建針對HER-2基因的pGU6/GFP/Neo-shRNA-HER-2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸癌HT-29細(xì)胞，在綠色熒光激發(fā)波長下細(xì)胞顯示為綠色，轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡攝片證實轉(zhuǎn)染成功。Westernblot檢測到轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的實驗組與未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的對照組比較，前者對HER-2蛋白表達(dá)有明顯抑制；MTT檢測的結(jié)果表明，重組質(zhì)粒對H