核干細(xì)胞因子RNA干擾對(duì)HT29細(xì)胞CDX2表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景及目的
　　 Barrett'食管(BE)是指食管下段復(fù)層鱗狀上皮被化生的單層柱狀所替代的一種病理現(xiàn)象,可伴腸化或無(wú)腸化,其中伴有特殊腸上皮化生者屬于食管腺癌的癌前病變。BE是胃食管反流病的并發(fā)癥,約0.5-1％的患者將發(fā)展為食管腺癌。越來(lái)越多的研究認(rèn)為,BE起源于食管粘膜基底層的干細(xì)胞,BE細(xì)胞來(lái)源于干細(xì)胞更能解釋BE細(xì)胞的分化。在正常生物體的發(fā)育過(guò)程中,同源盒基因CDX2對(duì)消化道尤其是結(jié)腸和小腸上皮的發(fā)育起著關(guān)鍵的作

2、用,是BE中腸化診斷的非常有用的標(biāo)志物。核干細(xì)胞因子(nucleostemin,NS)存在于干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的核仁中,而在已分化的成體細(xì)胞中不表達(dá),其參與干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控。但NS在BE的發(fā)生、發(fā)展中作用仍不清楚。
　　 在本研究中,我們假設(shè)食管干細(xì)胞中NS表達(dá)減少可能導(dǎo)致CDX2表達(dá)的激活,從而導(dǎo)致干細(xì)胞向腸型細(xì)胞分化,繼而形成腸化生。而HT29細(xì)胞株可以用來(lái)作為不同成分的胃十二指腸返流物對(duì)BE發(fā)生中細(xì)胞和分子事件效應(yīng)

3、研究的體外模型。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè),我們運(yùn)用RNAi技術(shù)沉默HT29細(xì)胞中NS的表達(dá),了解其對(duì)CDX2表達(dá)的影響,同時(shí)也檢測(cè)了鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDC)孵育HT29細(xì)胞后NS與CDX2的表達(dá)。
　　 研究方法
　　 1、根據(jù)NS基因序列(GeneBank NM_206826),通過(guò)www.genscript.com網(wǎng)站在線siRNA設(shè)計(jì)工具,設(shè)計(jì)三對(duì)siRNA,定向插入到質(zhì)粒pRNAT

4、-U6.1/Neo,抽提質(zhì)粒并測(cè)序鑒定。構(gòu)建好的三對(duì)NS干擾載體分別命名為pRNAi-1,pRNAi-2與pRNAi-3。將細(xì)胞種植于6孔板,待細(xì)胞融合率達(dá)80％～90％時(shí),用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建好的NS干擾載體與空載體轉(zhuǎn)入HT29細(xì)胞,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
　　 2、采用不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)NS RNAi后HT29細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、克隆形成能力的變化。
　　 3、用100μM、500μM、1

5、000μM的鵝脫氧膽酸孵育HT29細(xì)胞,分別于0小時(shí)、2小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后用胰酶消化收獲細(xì)胞,其中0小時(shí)為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。
　　 4、運(yùn)用RT-PCR與Western Blot法檢測(cè)HT29細(xì)胞中NS與CDX2的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1、測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì),插入寡核苷酸序列與設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)序列完全吻合,說(shuō)明重組載體構(gòu)建成功,經(jīng)過(guò)G418篩選和克隆挑選,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,轉(zhuǎn)染細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光。

6、r>　　 2、MTT實(shí)驗(yàn)表明干擾組細(xì)胞增殖能力明顯低于HT29組和空載體組;平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)表明干擾組單個(gè)細(xì)胞形成克隆的能力與HT29組和空載體組相比顯著降低;流式細(xì)胞生長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)表明,與HT29組和空載體組細(xì)胞相比,干擾組G0/G1期細(xì)胞比例增加,而S期細(xì)胞比例下降。
　　 3、3條siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒均能有效抑制NS的表達(dá),以pRNAi-1作用效果最為明顯,pRNAi-1組較陰性對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有CDX2的增強(qiáng)表達(dá)。

7、
　　 4、CDC孵育HT29細(xì)胞后,NS表達(dá)降低,CDX2表達(dá)增高,且兩者的表達(dá)與CDC呈濃度與時(shí)間依賴性。CDC孵育HT29細(xì)胞在100μM的T2、T12、T24時(shí)相點(diǎn)與500μMT2、T12時(shí)相點(diǎn),未見(jiàn)CDX2的增強(qiáng)表達(dá),與對(duì)照組T0表達(dá)相近,NS的表達(dá)也與對(duì)照組T0表達(dá)相近,濃度為500μM時(shí),T24時(shí)相點(diǎn)與1000μM T2、T12、T24時(shí)相點(diǎn)CDX2濃度呈逐漸增強(qiáng)表達(dá)趨勢(shì),NS的表達(dá)則為逐漸下降:尤其是在濃度為10