核干細(xì)胞因子特異性短發(fā)夾狀RNA的體內(nèi)外干擾作用研究.pdf

1、目的：核干細(xì)胞因子(nucleostemin，NS)是新發(fā)現(xiàn)的一個蛋白，位于干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的核仁上。當(dāng)細(xì)胞處于早期多潛能狀態(tài)增殖時NS呈高豐度表達(dá)，細(xì)胞開始分化時它的表達(dá)在細(xì)胞退出細(xì)胞周期之前迅速顯著下調(diào)。它可能扮演了維持干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞自我更新的角色，NS缺失或過度表達(dá)均可使干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖減弱。在造血系統(tǒng)中，NS被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于有c-kit+/lin-標(biāo)志的骨髓干細(xì)胞中，但在成熟粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞中則沒有。急性白血病是造血干細(xì)胞的

2、惡性克隆性疾病，我們應(yīng)用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞系HL-60和K562細(xì)胞中NS呈高表達(dá)。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是基因轉(zhuǎn)錄后沉默作用(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)的重要機(jī)制之一，小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)能高效特異地阻抑特定基因的表達(dá)。短發(fā)夾狀RNA(shorthairpinRNA，shRNA)在胞質(zhì)內(nèi)被核酸

3、酶(Dicer)切割成siRNAs，發(fā)揮對靶基因的抑制作用。shRNA化學(xué)穩(wěn)定性更高，又可在體外大量合成，易于篩選有效序列。我們在體外合成NS特異性短發(fā)夾狀RNA并轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化和測定NS抑制率驗證NS-shRNA在體外對NS表達(dá)的干擾效果；最后我們用NS-shRNA治療被HL-60細(xì)胞致瘤的裸鼠，檢測瘤組織HL-60細(xì)胞中NS蛋白表達(dá)的情況以驗證NS-shRNA的體內(nèi)干擾效果。本研究為進(jìn)一步了解白血病的發(fā)病機(jī)

4、制和研究以RNA干擾(RNAi)為手段的白血病基因治療可行性提供實驗數(shù)據(jù)和資料。 方法：(1)用RT-PCR方法檢測NS基因在HL-60和K562兩型白血病細(xì)胞系中的表達(dá)水平。 (2)體外合成NS特異性短發(fā)夾狀RNA。 (3)將NS-shRNA轉(zhuǎn)染到HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)作用48h后，分別通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化和RT-PCR以及免疫組化的方法檢測NS-shRNA對NS表達(dá)的干擾效果。 (4)用HL-60細(xì)胞

5、致瘤裸鼠并將成瘤裸鼠分為2組：對照組和治療組(裸鼠腹腔內(nèi)注射NS-shRNA)，用免疫組化的方法檢測瘤組織HL-60細(xì)胞內(nèi)NS蛋白表達(dá)情況。 (5)所得結(jié)果運用SPSSl0.0統(tǒng)計軟件包處理，采用t檢驗，以α=0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。 結(jié)果：(1)核干細(xì)胞因子在白血病細(xì)胞中的表達(dá)：NS在白血病細(xì)胞系HL-60和K562細(xì)胞中呈高豐度表達(dá)；細(xì)胞分化停止在早期階段的K562白血病細(xì)胞其NS表達(dá)豐度明顯高于細(xì)胞分化停止在后期

6、階段的HL-60細(xì)胞，差異有顯著性(P＜0.05)。 (2)核干細(xì)胞因子特異性短發(fā)夾狀RNA(NS-shRNA)的體外阻斷試驗：體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞經(jīng)NS-shRNA作用48h后，細(xì)胞密度和聚集程度下降，細(xì)胞之間大小相差懸殊，經(jīng)NS-shRNA-2作用的HL-60細(xì)胞一部分由圓形變成了梭形并有明顯的偽足；RT-PCR和免疫組化分析結(jié)果均顯示明顯抑制了HL-60細(xì)胞中部分NS的表達(dá)。與正常對照之間存在顯著性差異：其中NS-sh

7、RNA-1組和NS-shRNA-2組之間也存在顯著性差異。與對照組相比NS-shRNA-1和NS-shRNA-2對NS表達(dá)的抑制率分別達(dá)到37.83％和74.42％(RT-PCR)以及43.16％and71.52％(免疫組化)。 (3)核干細(xì)胞因子特異性短發(fā)夾狀RNA(NS-shRNA)的體內(nèi)阻斷試驗：與對照組裸鼠長出的瘤組織相比，腹腔內(nèi)注射NS-shRNA-2治療的裸鼠瘤組織HL-60白血病細(xì)胞的NS蛋白表達(dá)明顯減少，抑制率達(dá)