Flt3L與RANTES細胞因子佐劑對抗原特異性免疫應(yīng)答的增強及抗腫瘤作用.pdf

1、目的：抗原特異性免疫應(yīng)答的誘生很大程度上取決于機體對該抗原分子的處理和遞呈的效率。樹突狀細胞(dentritic cells，DCs)是體內(nèi)的專職抗原遞呈細胞，具有活躍地攝取、處理抗原的能力，可有效地向T細胞呈遞抗原、激發(fā)初次細胞免疫應(yīng)答。因此，在抗原注射部位DCs的數(shù)量及其對抗原的攝取能力是制約抗原特異性免疫應(yīng)答的重要因素?；贒Cs在免疫應(yīng)答中具有重要作用，如果招募包括DCs在內(nèi)的APCs至靶抗原所在部位，增加對抗原的攝取和遞呈，則

2、有利于增強免疫效果。 Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)為集落刺激因子家族成員之一，屬于酪氨酸激酶受體，可刺激CD34+造血干細胞的增殖和分化，并誘導(dǎo)特定亞群的DC細胞成熟。通過注射F1t3L可以使抗原特異性免疫反應(yīng)顯著增強，并顯著增加DC的數(shù)量和頻率。另外，F(xiàn)lt3L與多種細胞因子有協(xié)同作用，是一種良好的DCs細胞擴增劑。RANTES(regulated uponactivatio

3、n normal T cell expressed and secreted)即CCL5是趨化因子CC家族的重要代表之一，主要趨化單核細胞、初始T細胞及活化T細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞，其趨化活性是MIP-1的10倍。 核酸疫苗作為第三代疫苗，在抗感染、抗腫瘤免疫的研究中有著巨大潛力和應(yīng)用價值，但由于其免疫原性較低，單獨使用核酸疫苗很難誘導(dǎo)出具有預(yù)防和治療作用的強大且持續(xù)性的細胞免疫應(yīng)答。因而，近些年核酸疫苗的設(shè)計和研究主

4、要集中在如何提高其免疫原性及誘導(dǎo)較強的細胞免疫應(yīng)答上。具有調(diào)節(jié)作用的細胞因子能夠有效激活和調(diào)節(jié)免疫活性細胞，促進其分化和增生，經(jīng)細胞因子活化后的專職性抗原提呈細胞能夠有效地激活抗原特異性CTL細胞。而具有趨化作用的趨化因子能夠趨化抗原提呈細胞在淋巴組織中的定位，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)的強弱。將細胞因子或趨化因子與其他一些免疫調(diào)節(jié)分子聯(lián)用，作為佐劑協(xié)同核酸疫苗進行免疫，共同調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫細胞，最終達到增強免疫效果的目的。本研究中我們克隆了小鼠Fl

5、t3L/RANTES基因，構(gòu)建了真核表達載體pFlt3L/pRANTES；另外，為了能通過小鼠體內(nèi)評價系統(tǒng)研究Flt3L及RANTES的分子佐劑效應(yīng)，構(gòu)建了表達HBc抗原的真核表達質(zhì)粒pHBc作為模型核酸疫苗，并建立了穩(wěn)定表達HBcAg的小鼠黑色素瘤細胞株B16-HBc。通過動物實驗觀察了真核重組表達質(zhì)粒pFlt3L及pRANTES對攜帶HBc抗原的DNA疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性免疫應(yīng)答的促進作用。同時為了能夠更好的誘導(dǎo)出細胞免疫反應(yīng)，我們

6、采用經(jīng)攜帶HBc抗原的DNA疫苗初免及原核表達的HBc顆粒蛋白加強免疫的“Prime-Boost”免疫方案免疫小鼠，同時以真核表達載體pFlt31和pRANTES作為佐劑，研究了Flt3L/RANTES聯(lián)合應(yīng)用在Prime-boost免疫策略中對穩(wěn)定表達HBcAg的小鼠黑色素瘤細胞(B16-HBc細胞)攻擊的免疫保護作用，并對可能的機制進行了探索。 方法： 1.真核表達載體pF1t3L、pRANTES的構(gòu)建及F1t3L與

7、RANTES生物學(xué)活性鑒定采用RT-PCR方法從小鼠骨髓及外周血單個核細胞擴增得到F1t3L及RANTES全長基因片斷，分別克隆到真核表達載體pcDNA3.1/V5-His，得到重組表達質(zhì)粒pF1t3L和pRANTES。將pF1t3L和pRANTES分別用脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染HepG2細胞，然后采用骨髓細胞增殖及趨化小室實驗檢測細胞上清F1t3L及RANTES兩種細胞因子的生物學(xué)活性。另外，為了進一步檢測pF1t3L、pRANTES或pF1

8、t3L/pRANTES混合質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)招募炎性細胞的浸潤情況，以PBS、pcDNA3.1/V5-His、pF1t3L、pRANTES及pF1t3L/pRANTES混合質(zhì)粒，給小鼠腿部肌肉注射，一周后，取注射局部肌肉組織，常規(guī)進行石蠟切片及HE染色。 2.真核表達載體pHBc的構(gòu)建及穩(wěn)定表達HBc的小鼠黑色素瘤B16-HBc的建立構(gòu)建表達HBcAg的真核表達質(zhì)粒pHBc作為模型核酸疫苗；同時將pHBc經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B

9、16細胞，G418篩選陽性克隆，并分別采用RT-PCR和Western blot檢測陽性克隆中HBc的表達，以此作為制備小鼠荷瘤模型的腫瘤細胞株。 3.用正常小鼠為模型對重組質(zhì)粒pF1t3L和pRANTES對DNA疫苗的免疫促進作用進行評價將pF1t3L和pRANTES單獨或聯(lián)合使用與攜帶HBc抗原的DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射法免疫小鼠，即將小鼠分為pF1t3L/pHBc組(F組)、pRANTES/pHBc組(R組)及pF1t3L/p

10、RANTES/pHBc組(F/R組)，以pcDNA3.1/V5-His(P組)和pHBc組(H組)為陰性對照，每2周一次，共免疫3次。采用MTT法檢測脾淋巴細胞增殖、流式細胞儀檢測小鼠脾臟中表達IFN-γ的CD8+T淋巴細胞數(shù)、ELISA法檢測脾淋巴細胞培養(yǎng)上清IL-4含量及乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測特異性CTL殺傷活性。 4 用荷瘤小鼠模型觀察重組表達質(zhì)粒pFlt3L和pRANTES在DNA/prime-protein/boost

11、免疫策略中對免疫應(yīng)答的促進作用將兩種重組真核表達質(zhì)粒pFlt3L和pRANTES聯(lián)合使用作為佐劑與攜帶HBc抗原的DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射進行免疫小鼠，然后以大腸桿菌表達的HBc顆粒蛋白加強，即給小鼠注射兩次pFlt3L/pRANTES/pHBc，一次HBc顆粒蛋白(DDS/Adj)，用DNA疫苗加強(DDD/Adj)或不使用佐劑的DNA疫苗(DDD)做對照。末次免疫后4天，給小鼠皮下移植穩(wěn)定表達HBcAg的小鼠黑色素瘤細胞株B16-HBc

12、，觀察腫瘤生長，并繪制腫瘤生長曲線。然后分別采用MTT法、流式細胞術(shù)、ELISA法及乳酸脫氫酶(LDH)釋放法分別檢測荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖、小鼠脾臟中表達IFN-γ的CD8+T淋巴細胞數(shù)、脾淋巴細胞培養(yǎng)上清IL-2、IL-4含量及特異性CTL殺傷活性。 結(jié)果： 1.真核表達載體pFlt3L/pRANTES的構(gòu)建及B16-HBc小鼠黑色素瘤細胞株的建立從C57BL/6小鼠骨髓及ConA刺激的外周血單個核細胞的總RNA中，

13、成功克隆了約708bp的Flt3L及271bp的RANTES基因，測序結(jié)果與GeneBank(AK020105及NM013653)公布的Flt3L及RANTES序列一致；成功構(gòu)建了真核表達載體pFlt3L和pRANTES：骨髓細胞增殖及趨化實驗證實了Flt3L及RANTES均有生物學(xué)活性。pFlt3L、pRANTES和pFlt3L/pRANTES混合質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)招募炎性細胞的浸潤情況結(jié)果顯示，pFlt3L、pRANTES和pFlt3L

14、/pRANTES混合質(zhì)粒，注射局部肌肉組織部位大量炎性細胞聚集，而PBS、pcDNA3.1/V5-His注射局部未見明顯細胞浸潤。說明pFlt3L、pRANTES單獨或混合在一起均可在體內(nèi)獲得有效表達，并表現(xiàn)出生物學(xué)活性。 2.Flt3L與RANTES細胞因子佐劑對DNA疫苗抗原特異性免疫應(yīng)答的促進作用pFlt3L和pRANTES聯(lián)合使用可顯著促進小鼠脾臟特異性淋巴細胞增殖反應(yīng)，刺激指數(shù)SI為1.222±0.068(P<0.05

15、)；小鼠脾臟中高表達IFN-γ的CD8+T淋巴細胞數(shù)在F、R和F/R組中，分別是3.35±0.81％、1.72±0.50％、7.71±1.04％，與對照組比均有顯著差異(P<0.05或P<0.01)；而IL-4表達水平在各組無顯著區(qū)別(P>0.05)；小鼠脾細胞特異性CTL活性檢測中，當(dāng)效靶比為50:1時，F(xiàn)lt3L/RANTES組顯著高于其他各組(均P<0.05)。 3.Flt3L及RANTES對Prime-boost免疫策略

16、中抗原特異性免疫應(yīng)答的增強及抗腫瘤作用真核表達載體pFlt3L及pRANTES與核酸疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，腫瘤細胞接種17天后，佐劑聯(lián)合DNA疫苗免疫經(jīng)蛋白加強組(DDS/Adj組)瘤體積最小，為888.5mm3，與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，佐劑聯(lián)合DNA疫苗免疫組(DDD/Adj組)及DDS/Adj組均可顯著促進特異性淋巴細胞增殖反應(yīng)(P<0.05)，且DDS/Adj組淋巴細胞增殖反應(yīng)顯著高于DDD/Adj組(P<0.05)

17、；與對照組比，各組小鼠脾臟高表達IFN-γ的CD8+T淋巴細胞數(shù)顯著升高(P<0.01)，IL-2表達水平顯著增高(P<0.05)，但IL-4表達水平在各組無顯著區(qū)別(P>0.05)；DDD/Adj及DDS/Adj組小鼠脾細胞抗原特異性CTL活性顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05)，且DDS/Adj組抗原特異性CTL活性顯著高于DDD/Adj組(P<0.05). 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建真核表達載體pFlt3L、pR