食管癌中癌睪抗原的表達(dá)及MAGE-A3特異性T細(xì)胞抗腫瘤作用影響因素的研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在檢測(cè)癌睪抗原在食管癌腫瘤組織中的表達(dá)并分析其同臨床參數(shù)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌腫瘤組織中高表達(dá)，并同不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步檢測(cè)了MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞在食管癌患者外周血中的比例和功能，并分析其比例和功能同食管癌臨床參數(shù)之間的相關(guān)性，證實(shí)了PD-1在低反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面高表達(dá)，PD-1+CD8+T細(xì)胞功能受損，阻斷PD-1/PD-L1通路能夠在一

2、定程度上增加MAGE-A3特異性T細(xì)胞的增殖能力和殺傷功能。腫瘤微環(huán)境中能夠產(chǎn)生大量的活性氧，PD-1+CD8+T細(xì)胞活性氧的表達(dá)水平升高，進(jìn)一步探討了活性氧清除劑谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷協(xié)同增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤效果。
　　第一部分：癌睪抗原在食管癌腫瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　方法：
　　1)RT-PCR檢測(cè)MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2和NY-ESO-1在食管癌腫瘤組織中的表達(dá)。

3、>　　2)分析癌睪抗原基因的表達(dá)同臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　3)免疫組化分析MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌組織中的表達(dá)并探討同預(yù)后之間的聯(lián)系。
　　4)體外實(shí)驗(yàn)探討MAGE-A3/MAGE-C2對(duì)腫瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響。
　　結(jié)果：
　　1)癌睪抗原在正常組織中不表達(dá)，在食管癌腫瘤組織中高表達(dá)，并具有較高的陽(yáng)性率。
　　2)MAGE-A3和MAGE-C2的表達(dá)同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期相關(guān)。

4、>　　3)MAGE-A3陽(yáng)性患者的生存期較MAGE-A3陰性患者生存期差，并能夠作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。
　　4)MAGE-A3和MAGE-C2同腫瘤細(xì)胞株的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)，下調(diào)MAGE-A3/C2的表達(dá)能夠降低腫瘤細(xì)胞株的成球能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力，并誘導(dǎo)間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論：
　　癌睪抗原在食管癌組織中具有較高的陽(yáng)性率，MAGE-A3的表達(dá)可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤細(xì)胞的成

5、球能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力，并可以作為免疫治療潛在的靶點(diǎn)。
　　第二部分：MAGE-A3抗原特異性T細(xì)胞的比例和功能在食管癌患者中的臨床意義
　　方法：
　　1)選擇HLA-A2和MAGE-A3共陽(yáng)性的患者，體外培養(yǎng)MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞，用MAGE-A3-Tetramer(KVAELVHFL)標(biāo)記腫瘤抗原特異性T細(xì)胞。
　　2)IFN-γ-ELSPOT和PI-AnnexinⅤ雙染法分別檢測(cè)了Tetra

6、mer+/CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力。
　　3)流式檢測(cè)Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的比例，分析MAGE-A3抗原特異性T細(xì)胞的比例和功能同臨床資料之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1)MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細(xì)胞在外周血中比例很低(＜0.01％)，經(jīng)負(fù)載肽段的DC刺激14d后，Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的比例均高于0.2％以上。Tetramer+/CD8+T細(xì)胞能夠?qū)

7、LA-A2+/MAGE-A3+食管癌細(xì)胞株產(chǎn)生特異性殺傷(MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞在體外具有殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，并能夠分泌CD107a和IFN-γ)。
　　2)Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的比例與年齡呈正相關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。CD107a的表達(dá)水平與臨床預(yù)后不良的參數(shù)呈負(fù)相關(guān)（如:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和腫瘤體積）(P＜0.05)。
　　3)功能性Tetramer+/CD8

8、+T細(xì)的比例能夠提示患者的預(yù)后。
　　結(jié)論：
　　MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細(xì)胞具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的功能可作為預(yù)測(cè)食管癌預(yù)后的指標(biāo)，有功能的MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的比例與患者的生存期呈正相關(guān)。本研究為靶向MAGE-A3抗原的疫苗治療和TCR基因修飾T細(xì)胞治療提供理論依據(jù)。
　　第三部分：PD-1在食管癌患者無(wú)反應(yīng)性T細(xì)胞表面高

9、表達(dá)
　　方法：
　　1)流式檢測(cè)MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)。
　　2)分選CD107a+/IFN-γ+和CD107a-/IFN-γ-MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞，Real-time PCR檢測(cè)CD107a+/IFN-γ+和CD107a-/IFN-γ-的MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)差異。
　　3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血、腫瘤組織和配對(duì)正常組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞

10、表面PD-1的表達(dá)，并比較了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中PD-1+CD8+T細(xì)胞和PD-1-CD8+T細(xì)胞功能的差異;對(duì)比了腫瘤組織和配對(duì)正常組織中抗原遞呈細(xì)胞和上皮源性細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。
　　4)檢測(cè)了阻斷PD-1/PD-L1對(duì)MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞增殖能力和功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1)PD-1在無(wú)反應(yīng)性MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面高表達(dá)。
　　2)PD-L1在腫瘤組

11、織中高表達(dá)，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中的PD-1+CD8+T細(xì)胞功能受限。
　　3)阻斷PD-1/PD-L1能夠在一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞的增殖和分泌內(nèi)因子的功能。
　　結(jié)論：
　　食管癌患者腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞表面高表達(dá)PD-1，且PD-1+CD8+T細(xì)胞功能受限。通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1能夠一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞的增殖能力和功能。
　　第四部分：谷胱甘肽聯(lián)合

12、阻斷PD-1/PD-L1通路協(xié)同增強(qiáng)MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤效果
　　方法：
　　1)檢測(cè)PD-1+/PD-1-CD8+T細(xì)胞凋亡的差異和活性氧表達(dá)的差異。
　　2)檢測(cè)活性氧清除劑谷胱甘肽對(duì)T細(xì)胞的ROS水平、凋亡和功能的影響。
　　3)體外檢測(cè)谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響。
　　4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在T細(xì)胞回輸?shù)幕A(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用谷胱甘肽和PD-1/PD-

13、L1阻斷對(duì)食管癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　5)分離荷瘤小鼠腫瘤組織中的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞治療組CD8+在腫瘤部位浸潤(rùn)的數(shù)目和分泌內(nèi)因子的功能。
　　結(jié)果：
　　1)PD-1+CD8+T細(xì)胞較PD-1-CD8+T細(xì)胞的ROS水平較高，且凋亡細(xì)胞比例明顯高于PD-1-CD8+T細(xì)胞。
　　2)谷胱甘肽能夠清除CD8+T細(xì)胞的ROS，減少PD-1+CD8+T細(xì)胞的凋亡。
　　3)谷胱甘肽聯(lián)

14、合阻斷PD-1/PD-L1協(xié)同增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞增殖能力和分泌內(nèi)因子的功能。
　　4)在體內(nèi)試驗(yàn)中，谷胱甘肽能夠協(xié)同增加阻斷PD-1/PD-L1對(duì)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤的功能，延緩腫瘤的生長(zhǎng)。
　　5)谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷能夠增加腫瘤部位浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)，同時(shí)增強(qiáng)其分泌內(nèi)因子的能力。
　　結(jié)論：
　　PD-1+CD8+T細(xì)胞具有較高水平的ROS和凋亡比例。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L

15、1阻斷協(xié)同減少ROS水平和細(xì)胞凋亡比例，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞增殖能力和分泌內(nèi)因子的功能。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。
　　結(jié)論：
　　1)癌睪抗原MAGE-A3在食管癌腫瘤組織中具有較高的陽(yáng)性率，MAGE-A3的表達(dá)并可以作為一個(gè)獨(dú)立評(píng)價(jià)食管癌預(yù)后的指標(biāo)。
　　2)MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞能夠特異性殺傷HLA-A2+/MAGE-A3+腫瘤細(xì)胞，功能性MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)