MAGE-A3基因的過(guò)表達(dá)對(duì)人肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:將攜帶MAGE-A3基因的慢病毒表達(dá)載體感染人肝癌細(xì)胞株HepG2及MHCC-97H，觀察慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的MAGE-A3基因的過(guò)表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2及MHCC-97H增殖、凋亡、細(xì)胞周期分布、侵襲及遷移的影響，探討MAGE-A3基因的生物學(xué)功能及在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，為臨床尋找新的治療策略奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將已構(gòu)建的MAGE-A3重組慢病毒表達(dá)載體感染 HepG2、MHCC-97H細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分三組，無(wú)感

2、染組（對(duì)照組）、空載體病毒感染組（LV-PGCFU-GFP組）、MAGE-A3重組病毒感染組(LV-MAGE-A3組)，倒置熒光顯微鏡觀察感染效率，RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)MAGE-A3在肝癌中的表達(dá)情況；MTT技術(shù)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MAGE-A3基因過(guò)表達(dá)前后HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、遷移及侵襲能力的變化；原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記 DNA鏈斷端分析法（

3、terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dutp-biotin nick end-labeling assay, TUNEL）檢測(cè)HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的凋亡情況，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM）分析HepG2、MHCC-97H細(xì)胞周期的改變。
　　結(jié)果：
　　1.病毒感染細(xì)胞后72h，倒置熒光顯微鏡可觀察到微量熒光表達(dá)，120h熒光達(dá)

4、到最強(qiáng)且穩(wěn)定，感染效率可達(dá)80％。RT-PCR和WesternBlot證實(shí)經(jīng)LV-MAGE-A3感染的細(xì)胞高效表達(dá)MAGE-A3基因與蛋白。
　　2.經(jīng)MTT檢測(cè)及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)LV-MAGE-A3感染組與無(wú)感染組和空載體病毒感染組相比體外生長(zhǎng)增殖能力無(wú)明顯區(qū)別（P>0.05）。
　　3.經(jīng)TUNEL技術(shù)檢測(cè)HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)LV-MAGE-

5、A3感染組與無(wú)感染組及空載體病毒感染組相比細(xì)胞凋亡指數(shù)無(wú)明顯區(qū)別（P>0.05）。
　　4.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，在LV-MAGE-A3感染組，HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的的遷移細(xì)胞數(shù)分別為（187±13.52）、（121±4.16），明顯高于無(wú)感染組及空載體病毒感染組遷移細(xì)胞數(shù)（HepG2, P=0.001, P=0.037;MHCC-97H,P=0.000,P=0.000）。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，在LV-MAGE-A3感染組，Hep

6、G2、MHCC-97H細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（164.00±9.64)、(59.5±1.00)，明顯高于無(wú)感染組及空載體病毒感染組侵襲細(xì)胞數(shù)（P值均為0.000）。
　　5. FCM分析HepG2、MHCC-97H細(xì)胞周期，結(jié)果顯示MAGE-A3的過(guò)表達(dá)可影響人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期分布，觀察到兩株細(xì)胞處于 S期細(xì)胞比例明顯增加，G1期細(xì)胞比例減少。表明HepG2、MHCC-97H細(xì)胞經(jīng)LV-MAGE-A3感染后進(jìn)入增殖期細(xì)胞比例提