MAGE-A3基因的過表達對人肝細胞癌生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:將攜帶MAGE-A3基因的慢病毒表達載體感染人肝癌細胞株HepG2及MHCC-97H，觀察慢病毒表達載體介導(dǎo)的MAGE-A3基因的過表達對人肝癌細胞HepG2及MHCC-97H增殖、凋亡、細胞周期分布、侵襲及遷移的影響，探討MAGE-A3基因的生物學(xué)功能及在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，為臨床尋找新的治療策略奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將已構(gòu)建的MAGE-A3重組慢病毒表達載體感染 HepG2、MHCC-97H細胞，實驗分三組，無感

2、染組（對照組）、空載體病毒感染組（LV-PGCFU-GFP組）、MAGE-A3重組病毒感染組(LV-MAGE-A3組)，倒置熒光顯微鏡觀察感染效率，RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測MAGE-A3在肝癌中的表達情況；MTT技術(shù)、平板克隆形成實驗、Transwell遷移及侵襲實驗檢測MAGE-A3基因過表達前后HepG2、MHCC-97H細胞的生長增殖、遷移及侵襲能力的變化；原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶標記 DNA鏈斷端分析法（

3、terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dutp-biotin nick end-labeling assay, TUNEL）檢測HepG2、MHCC-97H細胞的凋亡情況，并應(yīng)用流式細胞術(shù)（flow cytometry, FCM）分析HepG2、MHCC-97H細胞周期的改變。
　　結(jié)果：
　　1.病毒感染細胞后72h，倒置熒光顯微鏡可觀察到微量熒光表達，120h熒光達

4、到最強且穩(wěn)定，感染效率可達80％。RT-PCR和WesternBlot證實經(jīng)LV-MAGE-A3感染的細胞高效表達MAGE-A3基因與蛋白。
　　2.經(jīng)MTT檢測及平板克隆形成實驗觀察HepG2、MHCC-97H細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)LV-MAGE-A3感染組與無感染組和空載體病毒感染組相比體外生長增殖能力無明顯區(qū)別（P>0.05）。
　　3.經(jīng)TUNEL技術(shù)檢測HepG2、MHCC-97H細胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)LV-MAGE-

5、A3感染組與無感染組及空載體病毒感染組相比細胞凋亡指數(shù)無明顯區(qū)別（P>0.05）。
　　4.細胞遷移實驗顯示，在LV-MAGE-A3感染組，HepG2、MHCC-97H細胞的的遷移細胞數(shù)分別為（187±13.52）、（121±4.16），明顯高于無感染組及空載體病毒感染組遷移細胞數(shù)（HepG2, P=0.001, P=0.037;MHCC-97H,P=0.000,P=0.000）。侵襲實驗顯示，在LV-MAGE-A3感染組，Hep

6、G2、MHCC-97H細胞的侵襲細胞數(shù)分別為（164.00±9.64)、(59.5±1.00)，明顯高于無感染組及空載體病毒感染組侵襲細胞數(shù)（P值均為0.000）。
　　5. FCM分析HepG2、MHCC-97H細胞周期，結(jié)果顯示MAGE-A3的過表達可影響人肝癌細胞株的細胞周期分布，觀察到兩株細胞處于 S期細胞比例明顯增加，G1期細胞比例減少。表明HepG2、MHCC-97H細胞經(jīng)LV-MAGE-A3感染后進入增殖期細胞比例提