miR-663a對肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2015年我國肝癌新發(fā)病例及死亡病例分別估計(jì)為46.6萬人和42.2萬人，位列全部惡性腫瘤的第四位和第三位。由于90％以上的原發(fā)性肝癌為肝細(xì)胞癌，因此，不斷深入研究并發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌重要的分子標(biāo)志物及關(guān)鍵生物治療靶點(diǎn)，對于提高肝細(xì)胞癌綜合療效具有重要的臨床意義。miR-663a位于人染色體20q11.1，其被報(bào)道與細(xì)胞分化，炎癥反應(yīng)，自身免疫疾病及腫瘤形成等多種生物學(xué)行為的發(fā)生

2、密切相關(guān)。有報(bào)道m(xù)iR-663a作為一種抑癌基因，抑制骨髓瘤，腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤，胰腺癌，急性白血病，結(jié)腸癌，胃癌及甲狀腺癌等多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞的增殖，侵襲及克隆形成等生物學(xué)行為;同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)miR-663a作為一種致癌基因，具有促進(jìn)卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞，雄激素抵抗前列腺癌細(xì)胞，乳腺癌耐藥細(xì)胞，黑色素瘤細(xì)胞，鼻咽癌細(xì)胞及肺癌細(xì)胞的增殖能力。雖然有研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中存在大量發(fā)揮表觀調(diào)控作用的非編碼RNA表達(dá)異常，但miR-663a在肝細(xì)胞癌

3、中的表達(dá)情況及其作用目前尚不清楚。基于miRNA具有保守性、時(shí)序性及組織特異性等特征，鑒于此，本研究擬探討miR-663a在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義、研究其對肝細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能涉及的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析肝細(xì)胞癌組織中miR-663a表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系;通過qRT-PCR檢測肝細(xì)胞癌臨床樣本中miR-663a表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系。2、構(gòu)

4、建miR-663a過表達(dá)及沉默肝細(xì)胞癌細(xì)胞系:通過MTS法檢測miR-663a對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖活力的影響;利用EdU及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-663a對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響;采用PI染色法檢測miR-663a對肝細(xì)胞癌細(xì)胞周期的影響;應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miR-663a對肝細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響;通過AnnexinⅤ-PI染色法檢測miR-663a對肝細(xì)胞癌細(xì)胞化療藥物敏感性的影響。3、運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-66

5、3a靶基因;采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對miR-663a靶基因TGF-β1進(jìn)行驗(yàn)證;利用qRT-PCR及Western blot驗(yàn)證miR-663a調(diào)控TGF-β1基因的表達(dá);應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-663a通過調(diào)控靶基因TGF-β1影響肝細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力;在肝細(xì)胞癌組織中通過qRT-PCR檢測miR-663a與靶基因TGF-β1的表達(dá)情況，并進(jìn)一步利用Pearson分析二者表達(dá)相關(guān)情況。4、利用免疫熒光及West

6、ern blot方法觀察并檢測GOLPH3在肝細(xì)胞癌細(xì)胞的表達(dá)及分布情況;通過AnnexinⅤ-PI染色法檢測miR-663a對GOLPH3調(diào)控的肝細(xì)胞癌細(xì)胞化療藥物敏感性的作用。
　　結(jié)果：
　　1、miR-663a在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義的研究:(1)miR-663a在肝細(xì)胞癌組織的表達(dá)水平顯著低于其配對癌旁組織;(2)miR-663a在肝細(xì)胞癌組織的表達(dá)水平與腫瘤大小和數(shù)量密切相關(guān)，即miR-663a高表達(dá)的

7、肝細(xì)胞癌組織與miR-663a低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織相比:其腫瘤體積相對較小，腫瘤數(shù)目相對較少;(3)通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)miR-663a高低表達(dá)組之間的總體生存時(shí)間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但miR-663a高表達(dá)組肝細(xì)胞癌患者的總體生存時(shí)間較miR-663a低表達(dá)組肝細(xì)胞癌患者的總體生存時(shí)間有延長趨勢。2、miR-663a與肝細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系:(1)過表達(dá)miR-663a可以明顯抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖活性，減少肝細(xì)胞癌細(xì)胞G1期

8、比例，誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞停滯于S期，并同時(shí)降低肝細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力。(2)過表達(dá)miR-663a可增加化療藥物OXA和ADM誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡，增加細(xì)胞對OXA和ADM化療藥物的敏感性。3、miR-663a調(diào)控靶基因TGF-β1影響肝細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲能力的機(jī)制研究:(1)miR-663a通過靶向調(diào)控TGF-β1，抑制TGF-β1基因的表達(dá)及肝細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力;(2)在肝細(xì)胞癌組織中miR-663a的表達(dá)普遍下降，TGF-β1的表

9、達(dá)總體增加，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。4、miR-663a對GOLPH3調(diào)控的肝細(xì)胞癌細(xì)胞化療藥物敏感性的作用:(1)GOLPH3主要表達(dá)于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的胞漿中，且在細(xì)胞核中存在散在性分布;(2)在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中，過表達(dá)GOLPH3抑制miR-663a的表達(dá)，沉默GOLPH3促進(jìn)miR-663a的表達(dá);(3)轉(zhuǎn)染miR-663a可增加化療藥物5-Fu和OXA誘導(dǎo)的過表達(dá)GOLPH3 Bel-7402和HepG2細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞對5-Fu和OX

10、A化療藥物的敏感性。
　　結(jié)論：
　　miR-663a在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與患者腫瘤大小及數(shù)量密切相關(guān);miR-663a的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞周期，侵襲能力，細(xì)胞對化療藥物OXA及ADM的敏感性等作用密切相關(guān);miR-663a通過調(diào)控靶基因TGF-β1影響肝細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力，其二者在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān);在細(xì)胞核中呈散在分布的GOLPH3可能負(fù)性調(diào)控miR-663a的表達(dá)，進(jìn)而參與