DC-IL-23對膀胱癌生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究.pdf

1、1.研究背景:在我國膀胱腫瘤是發(fā)病率最高的泌尿系腫瘤疾病。大約在150年前，Virchow提出了炎癥是腫瘤發(fā)生的易感因素的假設(shè)。這個觀點來源于他所觀察到的現(xiàn)象：癌變組織常常在局部引起慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，炎癥細(xì)胞也常存在于被切除的腫瘤組織中。1970年，Burnet提出了免疫監(jiān)視理論：免疫系統(tǒng)能夠自發(fā)地鑒別腫瘤細(xì)胞并將其清除，發(fā)揮保護(hù)機(jī)體組織、對抗腫瘤發(fā)展的效應(yīng)。在過去的10余年的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示：易患慢性炎癥疾病的患者有較高的患癌風(fēng)

2、險；在世界范圍內(nèi)約有15％~20%的癌癥死亡與感染和炎癥有關(guān)，這個調(diào)查結(jié)果在一定程度上支持了Virchow的觀點。雖然有關(guān)免疫系統(tǒng)對癌癥的作用：抑癌或促癌特征的研究都有報道，但總的來講，大量數(shù)據(jù)顯示腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)過程更傾向于促進(jìn)腫瘤生長、進(jìn)展，腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生的免疫抑制作用遠(yuǎn)大于免疫系統(tǒng)應(yīng)發(fā)揮的有效抗腫瘤作用。腫瘤相關(guān)炎癥的分子機(jī)制的面紗正在逐漸揭開，但還未完全清楚，確定目標(biāo)分子是提高腫瘤診斷和治療的關(guān)鍵。
　　腫瘤微環(huán)境中

3、存在不同亞群的免疫效應(yīng)細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，這一事實證明了腫瘤免疫環(huán)境的復(fù)雜性。腫瘤誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞分化和功能的改變使這個獨特的環(huán)境更加復(fù)雜多變。樹突狀細(xì)胞（DCs）是一群特殊的細(xì)胞，DCs是連接固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的橋梁：捕獲外來抗原、遷移至淋巴器官、遞呈抗原至適應(yīng)性免疫細(xì)胞。DCs是目前發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)初始免疫反應(yīng)的最有效的抗原遞呈細(xì)胞，也是具有異質(zhì)性的細(xì)胞群體。它是具有不同表型和功能的亞群，在特定的環(huán)境中表現(xiàn)出促腫瘤或抑腫瘤的作用。

4、DCs在抗腫瘤免疫的啟動和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但是在腫瘤微環(huán)境中，DCs所具有的強(qiáng)大抗原遞呈功能效率明顯降低或失效。雖然對于DCs在腫瘤微環(huán)境中功能及效率低下的相關(guān)研究很多，也提出了涉及功能異常的各種信號通路和相關(guān)異常因素的可能性，但目前仍沒有可行的治療方式預(yù)防或逆轉(zhuǎn)腫瘤患者 DC的功能異常。進(jìn)一步深入理解腫瘤環(huán)境中的DC免疫學(xué)是改善腫瘤浸潤性DC功能相關(guān)治療方法的關(guān)鍵。
　　IL-23是重要的促炎細(xì)胞因子，主要由 DCs分泌。目

5、前為止 IL-23在腫瘤微環(huán)境中的作用仍有爭議，IL-23是STAT3調(diào)控基因，也是 STAT3激動劑。值得注意的是，在腫瘤細(xì)胞中STAT3持續(xù)活化可以傳播到周圍環(huán)境，并激活一系列的促腫瘤反應(yīng)。細(xì)胞應(yīng)激或細(xì)胞死亡會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞相關(guān)的炎癥介質(zhì)如 IL-6、ATP、前列腺素（PG）E2、熱休克蛋白（HSPs）活化釋放入腫瘤微環(huán)境中，并促進(jìn)DC分泌IL-23。有趣的是，PGE2能夠下調(diào)LPS刺激的單核細(xì)胞分泌IL-12。ATP活化DC的P2X

6、嘌呤受體7（P2RX7）受體，導(dǎo)致NDO樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎性小體活化，并分泌IL-1β。因此，很有可能是DC或巨噬細(xì)胞分泌IL-23、IL-6及NLRP3相關(guān)IL-1β促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)以分泌IL-17為主的免疫反應(yīng)，而不是促進(jìn)抗腫瘤的 Th1型免疫反應(yīng)。就此而言，危險信號誘導(dǎo)的 NLRP3活化以及腫瘤免疫中IL-23的作用都是值得進(jìn)一步研究的。
　　因此，對DC/IL-23在人膀胱尿路上皮癌中

7、的表達(dá)及分布特征，以及IL-23對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的生物學(xué)作用進(jìn)行研究。
　　2. DC/IL-23在人膀胱尿路上皮腫瘤中的分布特征
　　2.1.研究目的：DC細(xì)胞亞群、IL-23在人膀胱尿路上皮癌中的分布特征。
　　2.2.研究方法：通過免疫組化、Real-time PCR技術(shù)檢測人膀胱尿路上皮癌組織中DC細(xì)胞亞群、IL-23、IL-6、IL-17的分布特征，通過生物信息學(xué)分析進(jìn)一步驗證IL-23A在膀胱腫瘤組織中

8、的表達(dá)特征和臨床意義。
　　2.3.研究結(jié)果：
　　2.3.1.對照組中只存在CD1a+、CD11c+、CD209+未成熟DCs亞群，而CD123+pDCs和CD83+成熟DCs亞群幾乎完全缺失；
　　2.3.2.在膀胱腫瘤組織中CD11c+、IL-23p19+mDCs、CD123+pDCs以及CD1a+, CD209+未成熟DCs和CD83+成熟DCs數(shù)量顯著增多；
　　2.3.3.與非肌層浸潤性膀胱腫瘤組比較

9、，肌層浸潤性膀胱腫瘤組織中CD11c+, CD123+, CD1a+, CD209+DCs數(shù)量顯著增多，而CD83+DCs數(shù)量有減少趨勢；
　　2.3.4.與癌旁組織比較，IL-23、IL-23R、IL-17、IL-6在人膀胱尿路上皮癌組織中表達(dá)顯著增高；
　　2.3.5.與正常膀胱組織比較，非肌層浸潤性尿路上皮癌癌旁組織IL-23A的表達(dá)水平無顯著增高，但在癌組織和肌層浸潤性尿路上皮癌癌旁組織表達(dá)水平顯著增高；
　　

10、2.3.6.與對應(yīng)的癌旁組織比較，非肌層浸潤性尿路上皮癌組織中的表達(dá)水平顯著增高，肌層浸潤性尿路上皮癌組比較無顯著差異。
　　2.3.7.與Grade2比較，IL-23A在Grade3膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)顯著增高。
　　2.3.8. Kaplan-Meier分析提示IL-23A在臨床組織樣本中的表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)趨勢。
　　2.4研究結(jié)論
　　2.4.1.生理狀態(tài)下，DC在組織中主要以未成熟狀態(tài)存在并維

11、持自身免疫耐受；腫瘤微環(huán)境中，大量免疫細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤，但功能失調(diào)；腫瘤惡性程度越高，能夠激活腫瘤特異性免疫反應(yīng)的CD83+成熟DC數(shù)量越少，與腫瘤微環(huán)境中DC失能以及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制有關(guān)。
　　2.4.2. IL-23、IL-23R、IL-17、IL-6在腫瘤組織中表達(dá)顯著升高；IL-23A表達(dá)水平與腫瘤分級呈正相關(guān)，與患者預(yù)后有負(fù)相關(guān)趨勢。隨著腫瘤惡性程度增高，癌旁組織中IL-23的表達(dá)水平有增加趨勢，比正常膀胱組織顯

12、著增高，這可能是促進(jìn)膀胱腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)的一個重要因素。
　　因此，DC亞群、IL-23在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)與腫瘤的分級具有顯著正相關(guān)性，與患者預(yù)后有負(fù)相關(guān)趨勢，這可能與膀胱腫瘤的高復(fù)發(fā)和免疫逃逸機(jī)制有關(guān)。
　　3.不同濃度IL-23對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　3.1.研究目的:IL-23對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的生物學(xué)作用。
　　3.2.研究方法:使用不同濃度IL-23作用于膀胱腫瘤細(xì)胞，觀察對其增殖

13、、遷移、侵襲的影響。
　　3.3.研究結(jié)果
　　3.3.1.低濃度IL-23（20ng/ml）促進(jìn)T24尿路上皮癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并上調(diào)增殖相關(guān)蛋白Ki67、PCNA表達(dá)；高濃度IL-23（40ng/ml）則發(fā)揮抑制作用。
　　3.3.2.低濃度IL-23（20ng/ml）誘導(dǎo)HUVEC血管生成，而高濃度IL-23（40ng/ml）則發(fā)揮抑制作用。
　　3.4.結(jié)論
　　3.4.1. IL-23以濃度

14、依賴性方式調(diào)節(jié)T24細(xì)胞增殖和EMT變化。
　　3.4.2. IL-23以濃度依賴性方式調(diào)節(jié)HUVEC血管生成。
　　4. IL-23調(diào)節(jié)T24細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究
　　4.1.研究目的:miR-200b-3p在IL-23調(diào)節(jié)T24細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化中的作用。
　　4.2.研究方法
　　4.2.1.觀察IL-23作用下T24細(xì)胞遷移、EMT相關(guān)蛋白的變化。
　　4.2.2.根據(jù)文獻(xiàn)報道和Real-ti

15、me PCR驗證，選擇具有顯著相關(guān)性的miR-200b-3p，觀察不同濃度IL-23對過表達(dá)miR-200b-3p T24細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的作用。
　　4.3研究結(jié)果
　　4.3.1. IL-2320ng/ml上調(diào) T24細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記 N-鈣粘蛋白、OB-鈣粘蛋白、Vimentin表達(dá)水平，下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)記E-鈣粘蛋白表達(dá)水平；IL-2340ng/ml作用則相反。
　　4.3.2.過表達(dá)miR-200-3p能夠抑制2

16、0ng/ml IL-23誘導(dǎo)的促T24細(xì)胞增殖、遷移作用，并抑制IL-23誘導(dǎo)的N-鈣粘蛋白、OB-鈣粘蛋白、Vimentin表達(dá)上調(diào)，逆轉(zhuǎn)20ng/ml IL-23誘導(dǎo)的E-鈣粘蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　4.4.結(jié)論:IL-23作用于miRNA200b-3p以濃度依賴性方式調(diào)節(jié)T24細(xì)胞增殖、遷移和EMT表型特征。
　　5.全文總結(jié)
　　5.1. DC在非腫瘤組織中主要以CD1a+、CD11c+、CD209+DCs亞群存在

17、；腫瘤微環(huán)境中CD11c+IL-23p19+mDCs、CD123+pDCs以及CD1a+, CD209+未成熟DCs和CD83+成熟DCs顯著增多；腫瘤惡性程度越高，CD83+成熟DCs數(shù)量越少?？赡艿臋C(jī)制有：生理狀態(tài)下，DC在組織中主要以未成熟狀態(tài)存在并維持自身免疫耐受；腫瘤微環(huán)境中大量免疫細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤，但功能失調(diào)；腫瘤惡性程度越高，能夠激活腫瘤特異性免疫反應(yīng)的CD83+成熟DCs數(shù)量越少，與腫瘤微環(huán)境中DC失能以及腫瘤細(xì)胞的免

18、疫逃逸機(jī)制有關(guān)。
　　5.2. IL-23、IL-23R、IL-17、IL-6在腫瘤組織中表達(dá)顯著升高，IL-23A表達(dá)水平與腫瘤分級、分期呈正相關(guān)，與患者預(yù)后有負(fù)相關(guān)趨勢。隨著腫瘤惡性程度增高，癌旁組織中IL-23A的表達(dá)水平有增加趨勢，比正常膀胱組織顯著增高，這可能是促進(jìn)膀胱腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)的一個重要因素。
　　5.3. IL-23以濃度依賴性方式調(diào)節(jié)T24細(xì)胞增殖、遷移和EMT表型特征，而這種調(diào)節(jié)作用受miRNA200b