DC-IL-23對膀胱癌生物學行為的影響及機制研究.pdf

1、1.研究背景:在我國膀胱腫瘤是發(fā)病率最高的泌尿系腫瘤疾病。大約在150年前，Virchow提出了炎癥是腫瘤發(fā)生的易感因素的假設。這個觀點來源于他所觀察到的現(xiàn)象：癌變組織常常在局部引起慢性炎癥反應的發(fā)生，炎癥細胞也常存在于被切除的腫瘤組織中。1970年，Burnet提出了免疫監(jiān)視理論：免疫系統(tǒng)能夠自發(fā)地鑒別腫瘤細胞并將其清除，發(fā)揮保護機體組織、對抗腫瘤發(fā)展的效應。在過去的10余年的流行病學調(diào)查結果顯示：易患慢性炎癥疾病的患者有較高的患癌風

2、險；在世界范圍內(nèi)約有15％~20%的癌癥死亡與感染和炎癥有關，這個調(diào)查結果在一定程度上支持了Virchow的觀點。雖然有關免疫系統(tǒng)對癌癥的作用：抑癌或促癌特征的研究都有報道，但總的來講，大量數(shù)據(jù)顯示腫瘤微環(huán)境中的免疫反應過程更傾向于促進腫瘤生長、進展，腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生的免疫抑制作用遠大于免疫系統(tǒng)應發(fā)揮的有效抗腫瘤作用。腫瘤相關炎癥的分子機制的面紗正在逐漸揭開，但還未完全清楚，確定目標分子是提高腫瘤診斷和治療的關鍵。
　　腫瘤微環(huán)境中

3、存在不同亞群的免疫效應細胞和免疫調(diào)節(jié)細胞，這一事實證明了腫瘤免疫環(huán)境的復雜性。腫瘤誘導的免疫細胞分化和功能的改變使這個獨特的環(huán)境更加復雜多變。樹突狀細胞（DCs）是一群特殊的細胞，DCs是連接固有免疫反應和適應性免疫反應的橋梁：捕獲外來抗原、遷移至淋巴器官、遞呈抗原至適應性免疫細胞。DCs是目前發(fā)現(xiàn)的誘導初始免疫反應的最有效的抗原遞呈細胞，也是具有異質(zhì)性的細胞群體。它是具有不同表型和功能的亞群，在特定的環(huán)境中表現(xiàn)出促腫瘤或抑腫瘤的作用。

4、DCs在抗腫瘤免疫的啟動和維持中發(fā)揮關鍵作用，但是在腫瘤微環(huán)境中，DCs所具有的強大抗原遞呈功能效率明顯降低或失效。雖然對于DCs在腫瘤微環(huán)境中功能及效率低下的相關研究很多，也提出了涉及功能異常的各種信號通路和相關異常因素的可能性，但目前仍沒有可行的治療方式預防或逆轉(zhuǎn)腫瘤患者 DC的功能異常。進一步深入理解腫瘤環(huán)境中的DC免疫學是改善腫瘤浸潤性DC功能相關治療方法的關鍵。
　　IL-23是重要的促炎細胞因子，主要由 DCs分泌。目

5、前為止 IL-23在腫瘤微環(huán)境中的作用仍有爭議，IL-23是STAT3調(diào)控基因，也是 STAT3激動劑。值得注意的是，在腫瘤細胞中STAT3持續(xù)活化可以傳播到周圍環(huán)境，并激活一系列的促腫瘤反應。細胞應激或細胞死亡會誘導腫瘤細胞相關的炎癥介質(zhì)如 IL-6、ATP、前列腺素（PG）E2、熱休克蛋白（HSPs）活化釋放入腫瘤微環(huán)境中，并促進DC分泌IL-23。有趣的是，PGE2能夠下調(diào)LPS刺激的單核細胞分泌IL-12。ATP活化DC的P2X

6、嘌呤受體7（P2RX7）受體，導致NDO樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎性小體活化，并分泌IL-1β。因此，很有可能是DC或巨噬細胞分泌IL-23、IL-6及NLRP3相關IL-1β促進Th17細胞的分化，誘導以分泌IL-17為主的免疫反應，而不是促進抗腫瘤的 Th1型免疫反應。就此而言，危險信號誘導的 NLRP3活化以及腫瘤免疫中IL-23的作用都是值得進一步研究的。
　　因此，對DC/IL-23在人膀胱尿路上皮癌中

7、的表達及分布特征，以及IL-23對膀胱尿路上皮癌細胞的生物學作用進行研究。
　　2. DC/IL-23在人膀胱尿路上皮腫瘤中的分布特征
　　2.1.研究目的：DC細胞亞群、IL-23在人膀胱尿路上皮癌中的分布特征。
　　2.2.研究方法：通過免疫組化、Real-time PCR技術檢測人膀胱尿路上皮癌組織中DC細胞亞群、IL-23、IL-6、IL-17的分布特征，通過生物信息學分析進一步驗證IL-23A在膀胱腫瘤組織中

8、的表達特征和臨床意義。
　　2.3.研究結果：
　　2.3.1.對照組中只存在CD1a+、CD11c+、CD209+未成熟DCs亞群，而CD123+pDCs和CD83+成熟DCs亞群幾乎完全缺失；
　　2.3.2.在膀胱腫瘤組織中CD11c+、IL-23p19+mDCs、CD123+pDCs以及CD1a+, CD209+未成熟DCs和CD83+成熟DCs數(shù)量顯著增多；
　　2.3.3.與非肌層浸潤性膀胱腫瘤組比較

9、，肌層浸潤性膀胱腫瘤組織中CD11c+, CD123+, CD1a+, CD209+DCs數(shù)量顯著增多，而CD83+DCs數(shù)量有減少趨勢；
　　2.3.4.與癌旁組織比較，IL-23、IL-23R、IL-17、IL-6在人膀胱尿路上皮癌組織中表達顯著增高；
　　2.3.5.與正常膀胱組織比較，非肌層浸潤性尿路上皮癌癌旁組織IL-23A的表達水平無顯著增高，但在癌組織和肌層浸潤性尿路上皮癌癌旁組織表達水平顯著增高；
　　

10、2.3.6.與對應的癌旁組織比較，非肌層浸潤性尿路上皮癌組織中的表達水平顯著增高，肌層浸潤性尿路上皮癌組比較無顯著差異。
　　2.3.7.與Grade2比較，IL-23A在Grade3膀胱尿路上皮癌組織中的表達顯著增高。
　　2.3.8. Kaplan-Meier分析提示IL-23A在臨床組織樣本中的表達與患者預后呈負相關趨勢。
　　2.4研究結論
　　2.4.1.生理狀態(tài)下，DC在組織中主要以未成熟狀態(tài)存在并維

11、持自身免疫耐受；腫瘤微環(huán)境中，大量免疫細胞及炎性細胞浸潤，但功能失調(diào)；腫瘤惡性程度越高，能夠激活腫瘤特異性免疫反應的CD83+成熟DC數(shù)量越少，與腫瘤微環(huán)境中DC失能以及腫瘤細胞的免疫逃逸機制有關。
　　2.4.2. IL-23、IL-23R、IL-17、IL-6在腫瘤組織中表達顯著升高；IL-23A表達水平與腫瘤分級呈正相關，與患者預后有負相關趨勢。隨著腫瘤惡性程度增高，癌旁組織中IL-23的表達水平有增加趨勢，比正常膀胱組織顯

12、著增高，這可能是促進膀胱腫瘤進展和復發(fā)的一個重要因素。
　　因此，DC亞群、IL-23在膀胱腫瘤組織中的表達與腫瘤的分級具有顯著正相關性，與患者預后有負相關趨勢，這可能與膀胱腫瘤的高復發(fā)和免疫逃逸機制有關。
　　3.不同濃度IL-23對膀胱尿路上皮癌細胞生物學行為的影響
　　3.1.研究目的:IL-23對膀胱尿路上皮癌細胞的生物學作用。
　　3.2.研究方法:使用不同濃度IL-23作用于膀胱腫瘤細胞，觀察對其增殖

13、、遷移、侵襲的影響。
　　3.3.研究結果
　　3.3.1.低濃度IL-23（20ng/ml）促進T24尿路上皮癌細胞增殖、遷移、侵襲，并上調(diào)增殖相關蛋白Ki67、PCNA表達；高濃度IL-23（40ng/ml）則發(fā)揮抑制作用。
　　3.3.2.低濃度IL-23（20ng/ml）誘導HUVEC血管生成，而高濃度IL-23（40ng/ml）則發(fā)揮抑制作用。
　　3.4.結論
　　3.4.1. IL-23以濃度

14、依賴性方式調(diào)節(jié)T24細胞增殖和EMT變化。
　　3.4.2. IL-23以濃度依賴性方式調(diào)節(jié)HUVEC血管生成。
　　4. IL-23調(diào)節(jié)T24細胞EMT轉(zhuǎn)化的機制研究
　　4.1.研究目的:miR-200b-3p在IL-23調(diào)節(jié)T24細胞EMT轉(zhuǎn)化中的作用。
　　4.2.研究方法
　　4.2.1.觀察IL-23作用下T24細胞遷移、EMT相關蛋白的變化。
　　4.2.2.根據(jù)文獻報道和Real-ti

15、me PCR驗證，選擇具有顯著相關性的miR-200b-3p，觀察不同濃度IL-23對過表達miR-200b-3p T24細胞EMT轉(zhuǎn)化的作用。
　　4.3研究結果
　　4.3.1. IL-2320ng/ml上調(diào) T24細胞間質(zhì)細胞標記 N-鈣粘蛋白、OB-鈣粘蛋白、Vimentin表達水平，下調(diào)上皮細胞標記E-鈣粘蛋白表達水平；IL-2340ng/ml作用則相反。
　　4.3.2.過表達miR-200-3p能夠抑制2

16、0ng/ml IL-23誘導的促T24細胞增殖、遷移作用，并抑制IL-23誘導的N-鈣粘蛋白、OB-鈣粘蛋白、Vimentin表達上調(diào)，逆轉(zhuǎn)20ng/ml IL-23誘導的E-鈣粘蛋白表達下調(diào)。
　　4.4.結論:IL-23作用于miRNA200b-3p以濃度依賴性方式調(diào)節(jié)T24細胞增殖、遷移和EMT表型特征。
　　5.全文總結
　　5.1. DC在非腫瘤組織中主要以CD1a+、CD11c+、CD209+DCs亞群存在

17、；腫瘤微環(huán)境中CD11c+IL-23p19+mDCs、CD123+pDCs以及CD1a+, CD209+未成熟DCs和CD83+成熟DCs顯著增多；腫瘤惡性程度越高，CD83+成熟DCs數(shù)量越少?？赡艿臋C制有：生理狀態(tài)下，DC在組織中主要以未成熟狀態(tài)存在并維持自身免疫耐受；腫瘤微環(huán)境中大量免疫細胞及炎性細胞浸潤，但功能失調(diào)；腫瘤惡性程度越高，能夠激活腫瘤特異性免疫反應的CD83+成熟DCs數(shù)量越少，與腫瘤微環(huán)境中DC失能以及腫瘤細胞的免

18、疫逃逸機制有關。
　　5.2. IL-23、IL-23R、IL-17、IL-6在腫瘤組織中表達顯著升高，IL-23A表達水平與腫瘤分級、分期呈正相關，與患者預后有負相關趨勢。隨著腫瘤惡性程度增高，癌旁組織中IL-23A的表達水平有增加趨勢，比正常膀胱組織顯著增高，這可能是促進膀胱腫瘤進展和復發(fā)的一個重要因素。
　　5.3. IL-23以濃度依賴性方式調(diào)節(jié)T24細胞增殖、遷移和EMT表型特征，而這種調(diào)節(jié)作用受miRNA200b