重組慢病毒CXCR7-shRNA對人膀胱癌細胞生物學行為影響的研究.pdf

1、第一章趨化因子受體CXCR7在人膀胱癌中的表達情況
　　 目的:研究CXCR7在人膀胱癌中的表達情況并篩選高表達CXCR7的人膀胱癌細胞株進入后續(xù)實驗
　　 方法:1.采用免疫組織化學SABC法檢測人膀胱癌、癌旁組織以及非癌膀胱組織中CXCR7的表達情況;分析CXCR7表達情況與膀胱癌病理分級、分期的關系;2.采用實時熒光定量PCR檢測人膀胱癌5637和T24細胞株中CXCR7-mRNA的表達情況
　　 結果:1

2、.CXCR7在膀胱癌中的表達明顯要高于癌旁組織(p＜0.05)及非癌膀胱組織(p＜0.05)，癌旁組織和正常膀胱組織之間CXCR7的表達差異無顯著性(p=0.55);2.膀胱癌組織中CXCR7的表達量與癌細胞病理分級(p=0.011)及病理分期(p＜0.05)相關。膀胱癌分化越差、分期越晚，CXCR7的表達量越高;3.CXCR7-mRNA在人膀胱癌5637細胞株中表達高于T24細胞株
　　 結論:1.CXCR7在膀胱癌組織中高表

3、達，且其表達水平與膀胱癌病理分級、分期呈正相關;2.人膀胱癌5637細胞株中CXCR7高表達，進入后續(xù)實驗
　　 第二章構建以慢病毒為載體的CXCR7-shRNA
　　 目的:篩選有效CXCR7-siRNA并構建LV-CXCR7-shRNA
　　 方法:1.設計三條CXCR7-siRNA序列，構建pSilencerTM4.1-CXCR7-shRNA和pcDNA3.1(+)-CXCR7過表達質粒共轉染293T細胞后

4、，通過QPCR和western blot篩選干擾效果最佳的CXCR7-siRNA序列;2.以干擾效果最佳的CXCR7-siRNA為基礎，采用Invitrogen公司生產(chǎn)的三質粒慢病毒載體系統(tǒng)（包括pAJ-U6--CMV-GFP/PuroR、pMD2.G和psPAX2）構建LV-CXCR-shRNA，為后續(xù)實驗做準備
　　 結果:1.將構建成功的pSilencerTM4.1-CXCR7-shRNA-1、2、3干擾質粒，與pcDNA

5、3.1(+)-CXCR7過表達質粒共轉染293T細胞后，細胞中CXCR7-mRNA和蛋白表達明顯下調(p＜0.05)，CXCR7-mRNA表達下調比例分別為93.0％、91.54％和89.06％。2.以CXCR7-siRNA-1為基礎構建的LV-CXCR7-shRNA測序結果顯示，重組質粒無突變和插入，結果符合預期;3.重組慢病毒質粒大量包裝后滴度測定結果為4.2×108，符合后續(xù)實驗要求
　　 結論:CXCR7-siRNA-1

6、為干擾效果最好序列，以此序列為基礎成功構建LV-CXCR7-shRNA
　　 第三章LV-CXCR7-shRNA干擾質粒對人膀胱癌5637細胞生物學行為的影響
　　 目的:研究LV-CXCR7-shRNA對5637細胞的干擾效果
　　 方法:將培養(yǎng)好的5367細胞分為三組:實驗組轉染LV-CXCR7-shRNA質粒;陰性對照組轉染LV-shRNA陰性對照質粒;空白組轉染空白慢病毒質粒。轉染后，1.分別采用QPCR

7、和western blot檢測各組細胞中CXCR7-mRNA和蛋白的表達情況;2.MTT實驗檢測各組細胞的增殖能力;3.Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲能力
　　 結果:1.所構建的重組質粒均成功轉染至各組5637細胞中;2.經(jīng)過QPCR及western blot檢測，shRNA組（實驗組）細胞中的CXCR7-mRNA和相應蛋白的表達量較Con組（陰性對照組）和NC組（空白組）明顯下調(p＜0.05);3.MTT實驗顯示