5-Aza-CdR對人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制的研究.pdf

1、背景：膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，其中移行細(xì)胞癌(BTCC)占90％以上，嚴(yán)重危害人民健康。近年來我國部分城市腫瘤發(fā)病率報(bào)告顯示，BTCC發(fā)病率有增高的趨勢。大部分膀胱癌患者確診時(shí)處于分化良好或中等分化的非肌層侵潤性膀胱癌，可予保留膀胱手術(shù)并行膀胱內(nèi)灌注化療或免疫治療，但術(shù)后容易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率高達(dá)50％～70％，其中10％～15％的病例惡性程度增高，易發(fā)展為浸潤性膀胱癌。因此探索膀胱癌有效治療的新方法已經(jīng)成為臨床上迫切需要解決的實(shí)際

2、問題，而且一直是研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。
　　 惡性腫瘤為多因素、多階段形成，其生物學(xué)特性表現(xiàn)為浸潤性生長和轉(zhuǎn)移，其發(fā)生機(jī)制在于細(xì)胞內(nèi)部基因結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了異常改變。在腫瘤發(fā)生多階段癌變過程中，癌基因的激活和/或抑癌基因的失活為其中兩個(gè)重要的分子學(xué)事件?，F(xiàn)代腫瘤理論認(rèn)為，在腫瘤的形成過程中包含兩大類機(jī)制，一個(gè)是遺傳學(xué)層面，即通過DNA核苷酸序列改變而形成突變；另一個(gè)就是表觀遺傳學(xué)層面，其研究的對象是基因表達(dá)的變化，這種變化可通過減數(shù)分

3、裂遺傳，不涉及有關(guān)基因DNA序列的改變。盡管不存在DNA核苷酸序列的改變，但通過DNA自身化學(xué)修飾方式從轉(zhuǎn)錄水平影響基因的表達(dá)，調(diào)控DNA功能，此機(jī)制在腫瘤的形成過程中越來越受到重視。DNA甲基化是目前表觀遺傳學(xué)上研究最深入的一種機(jī)制，是由甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，將胞嘧啶變?yōu)?-甲基胞嘧啶的一種反應(yīng)。腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)高甲基化異常是導(dǎo)致許多腫瘤抑制基因表達(dá)異常的內(nèi)在機(jī)制。相對于引起結(jié)構(gòu)異常的基因變異機(jī)制，屬于表觀遺傳學(xué)機(jī)制的DNA甲基化模

4、式隨著細(xì)胞分裂可得到穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，而同時(shí)甲基化的異常更易于被逆轉(zhuǎn)，在癌變過程中，使異常甲基化逆轉(zhuǎn)，特別是在癌變早期階段的轉(zhuǎn)變，對于腫瘤的防治尤為重要。由于高度甲基化而暫停表達(dá)的抑癌基因，如果能應(yīng)用去甲基化制劑逆轉(zhuǎn)甲基化的異常狀態(tài)，使之重獲表達(dá)，理論上即可發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能。
　　 DNA甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)，某些抑癌基因在腫瘤發(fā)生中存在著高甲基化而失活均已得到廣泛證實(shí)。本研究選用5-氮-2’-脫氧胞苷(5-Aza-Cd

5、R)作為去甲基化制劑來處理膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株T24。5-Aza-CdR是一種嘧啶類似物，由對2’-脫氧胞嘧啶第5位碳置換為氮獲得，在復(fù)制過程中的DNA分子結(jié)合階段，該制劑可與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)形成一個(gè)共價(jià)復(fù)合物，抑制該酶的轉(zhuǎn)移活性，從而形成低甲基化的子鏈，實(shí)現(xiàn)去甲基化功能。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR通過去甲基化作用可使多種含有啟動(dòng)子CpG島的高甲基化的抑癌基因重新表達(dá)，從而恢復(fù)其抑癌功能，這

6、一研究結(jié)果對于腫瘤的基因治療提供了一個(gè)新的思路。膀胱癌在臨床治療中應(yīng)用相應(yīng)的去甲基化制劑以改變膀胱癌癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，目前尚未見報(bào)道。膀胱腫瘤抑制基因的失活進(jìn)而導(dǎo)致蛋白表達(dá)下降的機(jī)制尚不是十分明確，國內(nèi)的系統(tǒng)研究甚少。
　　 第一章 XAF1與XIAP在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其相關(guān)性
　　 目的：研究BTCC患者中凋亡抑制蛋白XIAP和XIAP相關(guān)因子1(XAF1)的表達(dá)及其臨床意義。
　　 方法：用免疫組織

7、化學(xué)法檢測XIAP與XAF1在在56例BTCC和38例癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其與BTCC臨床病理因素的關(guān)系。同時(shí)取正常膀胱組織18例做對照。
　　 結(jié)果：膀胱癌組織中XIAP積分為7.13±3.11，明顯高于膀胱癌癌旁組織中的2.28±1.54和正常膀胱組織的1.43±1.48(P<0.01)；XAF1積分為3.04±2.61，明顯低于癌旁組織中的7.32±3.64和正常膀胱組織的8.44±3.04(P<0.01)。癌旁組

8、織與正常膀胱組織比較，XIAP積分差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，XAF1積分差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。XIAP積分在G3為9.82±4.30，G2的表達(dá)為7.65±2.01，G1的表達(dá)為4.82±2.21，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，XIAP積分與BTCC的病理分級呈正相關(guān)；XAF1積分在G3為0.85±0.99，G2的表達(dá)為2.66±2.20，G1的表達(dá)為4.24±2.04，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，

9、XAF1積分與BTCC的病理分級呈顯著負(fù)相關(guān)。復(fù)發(fā)膀胱癌組織中XIAP積分(8.46±4.52)高于初發(fā)癌組織(6.49±1.94)(P<0.05)。復(fù)發(fā)膀胱癌組織中XAF1積分(1.89±1.25)低于于初發(fā)癌組織(3.24±2.49)(P<0.05)。兩者積分在患者的不同性別、年齡段、腫瘤臨床分期的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在BTCC組織中XIAP表達(dá)與XAF1表達(dá)有相關(guān)性(P<0.05)，呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：<

10、br>　　 1.BTCC組織中XIAP的表達(dá)高于癌旁組織和正常膀胱組織，XAF1表達(dá)明顯降低；
　　 2.XIAP的表達(dá)高低與BTCC的腫瘤病理分級明顯相關(guān)，呈正相關(guān)，且復(fù)發(fā)腫瘤明顯高于初發(fā)腫瘤；XA目的表達(dá)也與BTCC的腫瘤病理分級明顯相關(guān)，呈負(fù)相關(guān)，而且復(fù)發(fā)膀胱癌明顯低于初發(fā)腫瘤；
　　 3.在BTCC組織中XIAP表達(dá)與XAF1表達(dá)相關(guān)，呈負(fù)相關(guān)。
　　 第二章 5-Aza-CdR對膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)

11、行為及化療敏感性的研究
　　 目的：探討5-Aza-CdR對人膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，即對細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響，及對其他化療藥敏感性的影響。
　　 方法：設(shè)定不同濃度的5-Aza-CdR作用于T24細(xì)胞，利用MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測T24細(xì)胞的凋亡指數(shù)；用MTT法檢測單用化療藥組，與用5-Aza-CdR合用組對T24細(xì)胞抑制率的差異。
　　 結(jié)果：MTT法檢測5-Aza-CdR(1uM，

12、5uM，10uM，15uM，30uM，45uM)作用于T24細(xì)胞24h后，對T24細(xì)胞的抑制率分別為5.55％，13.27％，15.37％，18.52％，36.50％，44.62％；48h后分別為7.47％，17.86％，21.81％，27.50％，56.67％，67.47％；72后分別為13.45％，25.82％，30.81％，44.25％，64.80％，77.26％。各時(shí)間點(diǎn)不同濃度組組與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且呈明顯的劑量效應(yīng)

13、關(guān)系(P<0.05)。同一濃度，抑制率與時(shí)間成正比，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MTT檢測不同濃度化療藥單用組及與5-Aza-CdR(1uM)合用組對T24細(xì)胞的抑制率差異。結(jié)果劑量相同的化療藥物，5-Aza-CdR處理后再用，其對細(xì)胞的抑制率明顯提高(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡率，對照組的凋亡率是(0.52±0.03)％，5-Aza-CdR處理1uM組的凋亡率是(4.57±0.53)％，15uM處理組的凋亡率是(1

14、2.24±1.09)％，30uM處理組的凋亡率是(25.58±2.68)％；各濃度組與對照組的細(xì)胞凋亡率相比差異性顯著(P<0.01)，隨5-Aza-CdR濃度增加，細(xì)胞的凋亡率增大，呈劑量依賴性關(guān)系(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.5-Aza-CdR作用于T24細(xì)胞后，對T24細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，并且呈明顯的時(shí)間劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 2.5-Aza-CdR預(yù)處理后，化療藥E-ADM與MCC對腫瘤

15、細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)。
　　 3.5-Az-CdR作用于 T24細(xì)胞后，明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡的誘導(dǎo)作用呈顯著劑量依賴性。
　　 第三章 5-Aza-CdR抑制人膀胱癌T24細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討5-Aza-CdR抑制人膀胱癌T24細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 方法：設(shè)定不同濃度的5-Aza-CdR作用于T24細(xì)胞48小時(shí)后，MSP檢測XAF1啟動(dòng)子基因甲基化情況，RT-PCR檢

16、測T24細(xì)胞的XAF1、XIAP、NF-KBP65的mRNA表達(dá)，Western blot檢測XAF1、XIAP、NF-KBP65蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：MSP檢測T24細(xì)胞XAF1基因啟動(dòng)子處于甲基化狀態(tài)，而在經(jīng)過5-Aza-CdR(1uM，15uM，30uM)去甲基化處理后，該基因呈去甲基化狀態(tài)。RT-PCR檢測，XAF1 mRNA表達(dá)比值(XAF1/GAPDH)分別為，1uM組：0.278±0.003，15uM組：0.4

17、04±0.020，30uM組：0.478±0.012。與對照組(0uM)0.6760±0.050比較，表達(dá)下調(diào)，并且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.01)；NF-KBP65 mRNA表達(dá)比值分別為，1uM組：0.364±0.015，15uM組：0.484±0.013，30uM組：0.778±0.018，與對照組：0.203±0.009比較基因的表達(dá)明顯上調(diào)，并且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.01)；XIAP mRNA各組的表達(dá)與對照組比較，無明顯差異

18、(P>0.05)。Western blot檢測，各組細(xì)胞XAF1蛋白表達(dá)比值分別為：1uM0.285±0.003，15uM0.350±0.003，30uM0.554±0.001，明顯低于對照組0.227±0.002(P<0.01)，XAF1基因在蛋白表達(dá)水平上隨5-Aza-CdR濃度的增高表達(dá)逐漸上升，并且呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.01)；NF-KBP65基因在蛋白表達(dá)比值：1uM組為0.262±0.005，15uM組為0.298±0.0

19、04，30uM組0.343±0.003與0uM組(0.195±0.002)比較有顯著性差異(P<0.05)；XIAP基因在蛋白各組的表達(dá)與對照組比較，無明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.膀胱癌T24細(xì)胞啟動(dòng)子XAF1基因處于甲基化狀態(tài)，經(jīng)5-Aza-CdR處理后，呈去甲基化狀態(tài)。
　　 2.5-Aza-CdR作用于T24細(xì)胞后，XAF1基因的表達(dá)上調(diào)，NF-KBP65基因的表達(dá)上調(diào)，并且均與5-