miR--520b對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　膀胱癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及許多基因表達(dá)、功能異常及多種信號通路的改變。當(dāng)前，膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子遺傳學(xué)機(jī)制尚不清楚。
　　MicroRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼單鏈小分子RNA，大小約21-25個核苷酸，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。許多研究表明，microRNA參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及等各個環(huán)節(jié)。microRNA在膀胱癌細(xì)胞中也存

2、在的異常表達(dá)，其可能在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中起著重要的作用。
　　miR-520b是最近發(fā)現(xiàn)的一種在腫瘤中異常表達(dá)的重要microRNA。初步研究發(fā)現(xiàn)，其在多種惡性腫瘤（包括膀胱癌在內(nèi)）中表達(dá)顯著下調(diào)，我們推測其對膀胱癌可能有抑癌作用。
　　目的:
　　本論文探討了miR-520b在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)功能，并對其相關(guān)的分子作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究。
　　方法:
　　1.在18對配對的組織標(biāo)本中進(jìn)行miR

3、-520b的相對表達(dá)量檢測，并統(tǒng)計分析miR-520b在膀胱癌及癌旁膀胱粘膜組織中的表達(dá)差異，以及miR-520b表達(dá)量與膀胱癌不同組織病理分期及分級之間的關(guān)系; RT-PCR驗(yàn)證miR-520b在膀胱癌細(xì)胞系(T24、UC3)與永生化人正常膀胱粘膜上皮細(xì)胞株SV-HUC-1的表達(dá)差異。
　　2.通過體外轉(zhuǎn)染miR-520b mimic的方式來進(jìn)行獲得性功能實(shí)驗(yàn)。上調(diào)miR-520b在膀胱癌細(xì)胞系T24、UC3中的表達(dá)，以CCK8

4、、平板克隆形成、流式細(xì)胞周期檢測等體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-520b對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響。以劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell小室遷移和侵襲來分析miR-520b過表達(dá)對細(xì)胞遷移、侵襲的影響;
　　3.運(yùn)用生物信息學(xué)方法，預(yù)測miR-520b可能的下游靶基因，并對預(yù)測的靶基因進(jìn)行功能聚類分析，結(jié)合文獻(xiàn)、預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等方法，初步判斷Cyclin D1可能是miR-520b的靶基因之一。利用Western Blot等進(jìn)行靶蛋白表達(dá)量的驗(yàn)證，利用

5、qRT-PCR、雙熒光素酶報告系統(tǒng)對miR-520b的作用的靶序列進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:
　　1.收集的18例膀胱癌組織標(biāo)本中，有16例為miR-520b相對低表達(dá)，占88.9％。癌組織中miR-520b表達(dá)量平均約癌旁組織的56％。肌層浸潤性膀胱癌與非肌層浸潤性膀胱癌以及高級別膀胱癌與低級別膀胱癌在miR-520b的相對表達(dá)量的平均值有差異，但在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性意義。
　　2.膀胱癌細(xì)胞株T24和UC3細(xì)胞同樣存在m

6、iR-520b低表達(dá)，與永生化的膀胱移行上皮細(xì)胞株SV-HUC-1相比，T24細(xì)胞和UC3細(xì)胞中miR-520b的表達(dá)量均約為SV細(xì)胞的1/2。
　　3.通過對T24細(xì)胞和UC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-520b mimic來過表達(dá)細(xì)胞中的miR-520b，可以抑制其生長。其抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性，在50nM miR-520b mimic處理48小時后，T24細(xì)胞和UC3細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到31.8％和34.0％。流式細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)miR-

7、520b mimic處理可以誘導(dǎo)T24細(xì)胞和UC3發(fā)生G1期阻滯，50nMmiR-520b mimic作用48小時后，T24細(xì)胞和UC3細(xì)胞G1期的比例分別增加12％和19％。而50nMmiR-520b mimic作用48小時后，流式細(xì)胞凋亡檢測提示miR-520b過表達(dá)并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-520b過表達(dá)可以抑制T24細(xì)胞和UC3細(xì)胞體內(nèi)外克隆形成能力。體外平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，miR-520b過表達(dá)使T24細(xì)胞和UC3的克隆形

8、成率分別下降7.5％（從18％降到10.5％）和10.6％（從21.8％降到11.2％）。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)提示miR-520b過表達(dá)不能抑制T24細(xì)胞和UC3細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　4.我們在T24細(xì)胞和UC3細(xì)胞中檢測到Cyclin D1、 CDK4、pRb和E2F3在miR-520b過表達(dá)后在蛋白水平有下調(diào)。進(jìn)一步行RT-PCR分析和雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析證實(shí)Cyclin D1是miR-520b的直接作用靶

9、點(diǎn)，其3'-UTR中存在miR-520b調(diào)控的作用序列。
　　結(jié)論:
　　1.與正常組織和細(xì)胞相比，膀胱癌組織和細(xì)胞中miR-520b的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著下調(diào)。但是本研究未能提示miR-520b表達(dá)量高低與膀胱癌的分級、分期相關(guān)。
　　2.過表達(dá)miR-520b使得膀胱癌細(xì)胞T24和UC3細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期G1期阻滯及增殖顯著抑制。同時，miR-520b的過表達(dá)還削弱了T24細(xì)胞和UC3細(xì)胞的克隆形成能力。
　　3.C