shRNA沉默RhoA對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,也是全球癌癥相關(guān)性的發(fā)病率和死亡率的一個(gè)重要原因。手術(shù)切除是首選治療方式。高達(dá)50％的患者由于初診時(shí)即存在隱性轉(zhuǎn)移灶最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特點(diǎn),其分子機(jī)制至今尚未明了。腫瘤發(fā)生和發(fā)展是多基因改變協(xié)同作用的過(guò)程,癌基因的激活與抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。Rho小GTP酶家族屬Ras超家族成員,通過(guò)激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生命過(guò)程,如細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞凋亡

2、等[1,2,3]。RhoA是Rho GTP酶家族的重要成員,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中高表達(dá),并和腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而,RhoA在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用還不是很清楚。國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)RhoA的shRNA結(jié)直腸癌細(xì)胞系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。因此,我們構(gòu)建針對(duì)RhoA的shRNA并轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo,特異性敲除其內(nèi)源性RhoA的表達(dá),分析結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移RhoA的作用,為探索結(jié)直腸癌基因治療提供一定的理論基礎(chǔ)。實(shí)

3、驗(yàn)分如下四部分進(jìn)行:
　　 第一章靶向RhoA基因的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的:為研究靶向RhoA基因的shRNA對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株體外生物學(xué)行為的影響,根據(jù)基因庫(kù)中的人RhoA基因序列,構(gòu)建針對(duì)RhoA基因的小干擾RNA(siRNA)及其表達(dá)載體。
　　 方法:設(shè)計(jì)RhoA靶向的發(fā)夾狀siRNA,BLAST同源分析證實(shí)其特異性,合成2條互補(bǔ)的寡核苷酸鏈共2對(duì),退火后連接入pGPU6/GFP/Ne

4、o載體,轉(zhuǎn)化后進(jìn)行酶切和序列鑒定。
　　 結(jié)果:設(shè)計(jì)出2條針對(duì)RhoA的siRNA,將退火后的雙鏈寡核苷酸片段克隆到pGPU6/GFP/Neo載體,經(jīng)過(guò)陽(yáng)性菌落酶切鑒定與測(cè)序,結(jié)果正確。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了包含靶向RhoA基因的shRNA的重組表達(dá)質(zhì)粒.
　　 第二章 RNA干擾抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo中RhoA的表達(dá)
　　 目的:研究將RhoA shRNA轉(zhuǎn)染入人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo觀察其對(duì)細(xì)胞Rh

5、oA表達(dá)的沉默效應(yīng)。
　　 方法:設(shè)計(jì)制備2對(duì)針對(duì)RhoA基因的shRNA,轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá);采用real-time RT-PCR法測(cè)定RhoA tuRNA的表達(dá),Western Blot測(cè)定RhoA蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:與未轉(zhuǎn)染的LoVo比較,LoVo-P1細(xì)胞RhoA mRNA與RhoA蛋白的表達(dá)強(qiáng)度分別為56.33％±2.18％,33.22％±2.27％,Western

6、 blot結(jié)果與real-time RT-PCR結(jié)果一致,和對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:構(gòu)建的RhoA shRNA能有效抑制LoVo細(xì)胞中RhoA基因的表達(dá);其中RhoA shRNA1干擾效果最佳。
　　 第三章 RNA干擾RhoA的表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo生物學(xué)行為的影響
　　 目的:研究RhoAshRNA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo體外增殖、凋亡、遷移侵襲能力的影響,并初步探討其可能

7、的機(jī)理。
　　 方法:以成功構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)shRNA的LoVo-P1為研究對(duì)象,以未轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞、LoVo-P0為對(duì)照,繪制三組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線比較生長(zhǎng)差異,計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間;MTT法比較三組細(xì)胞存活率的差異;細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室檢測(cè)三組細(xì)胞體外侵襲力的變化。
　　 結(jié)果:未轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞、LoVo-P0組細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)比較無(wú)明顯差異。與對(duì)照兩組的細(xì)胞比較,LoVo-P1組的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯

8、緩慢,從第四天開(kāi)始生長(zhǎng)速度明顯低于另外兩組,至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期更明顯,生長(zhǎng)曲線較平緩;LoVo-P1組的細(xì)胞的倍增時(shí)間31.24小時(shí)左右,延長(zhǎng)約10小時(shí)。LoVo-P1組的細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.05)。LoVo-P1組的細(xì)胞的粘附力明顯下降(P＜0.05)。LoVo-P1遷移到劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。LoVo-P1穿過(guò)Matrigel濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:RhoA干擾質(zhì)粒

9、P1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo的體外生長(zhǎng),使細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng),抑制癌細(xì)胞的體外粘附、遷移侵襲能力。
　　 第四章 RNA干擾沉默RhoA基因?qū)θ私Y(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:建立裸鼠皮下人結(jié)直腸癌種植瘤模型,研究RhoA基因沉默對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo裸鼠成瘤的影響。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組,即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RhoA shRNA的LoVo-P1組、未轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染空載體的LoVo-

10、P0組。將各組結(jié)腸癌細(xì)胞直接接種于裸鼠皮下,觀察種植瘤的生長(zhǎng)情況,4周后測(cè)量瘤體組織的體積和重量;免疫組化檢測(cè)腫瘤組織RhoA、VEGF、CD34(觀測(cè)微血管密度的變化)和MMP-2蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:LoVo-P1組的腫瘤生長(zhǎng)速度慢于其他兩組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)瘤體組織的體積與瘤重明顯低于其他兩組(P＜0.05)。免疫組化證實(shí)LoVo-P1組的腫瘤組織RhoA、VEGF和MMP-2蛋白表達(dá)降低(P＜0.05),微血