shRNA沉默RhoA對人結直腸癌細胞生物學行為的體內外實驗研究.pdf

1、結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,也是全球癌癥相關性的發(fā)病率和死亡率的一個重要原因。手術切除是首選治療方式。高達50％的患者由于初診時即存在隱性轉移灶最終死于腫瘤的復發(fā)。轉移是惡性腫瘤的基本特點,其分子機制至今尚未明了。腫瘤發(fā)生和發(fā)展是多基因改變協(xié)同作用的過程,癌基因的激活與抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子基礎。Rho小GTP酶家族屬Ras超家族成員,通過激活下游的信號傳導通路,參與調節(jié)細胞的多種生命過程,如細胞增殖、細胞運動和細胞凋亡

2、等[1,2,3]。RhoA是Rho GTP酶家族的重要成員,近年來研究發(fā)現在多種惡性腫瘤中高表達,并和腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移密切相關。然而,RhoA在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用還不是很清楚。國內外尚未見RhoA的shRNA結直腸癌細胞系統(tǒng)的實驗研究。因此,我們構建針對RhoA的shRNA并轉染至人結腸癌細胞株LoVo,特異性敲除其內源性RhoA的表達,分析結直腸癌侵襲和轉移RhoA的作用,為探索結直腸癌基因治療提供一定的理論基礎。實

3、驗分如下四部分進行:
　　 第一章靶向RhoA基因的shRNA表達載體的構建及鑒定
　　 目的:為研究靶向RhoA基因的shRNA對人結直腸癌細胞株體外生物學行為的影響,根據基因庫中的人RhoA基因序列,構建針對RhoA基因的小干擾RNA(siRNA)及其表達載體。
　　 方法:設計RhoA靶向的發(fā)夾狀siRNA,BLAST同源分析證實其特異性,合成2條互補的寡核苷酸鏈共2對,退火后連接入pGPU6/GFP/Ne

4、o載體,轉化后進行酶切和序列鑒定。
　　 結果:設計出2條針對RhoA的siRNA,將退火后的雙鏈寡核苷酸片段克隆到pGPU6/GFP/Neo載體,經過陽性菌落酶切鑒定與測序,結果正確。
　　 結論:成功構建了包含靶向RhoA基因的shRNA的重組表達質粒.
　　 第二章 RNA干擾抑制結腸癌細胞株LoVo中RhoA的表達
　　 目的:研究將RhoA shRNA轉染入人結腸癌細胞株LoVo觀察其對細胞Rh

5、oA表達的沉默效應。
　　 方法:設計制備2對針對RhoA基因的shRNA,轉染結腸癌細胞株LoVo,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達;采用real-time RT-PCR法測定RhoA tuRNA的表達,Western Blot測定RhoA蛋白的表達。
　　 結果:與未轉染的LoVo比較,LoVo-P1細胞RhoA mRNA與RhoA蛋白的表達強度分別為56.33％±2.18％,33.22％±2.27％,Western

6、 blot結果與real-time RT-PCR結果一致,和對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結論:構建的RhoA shRNA能有效抑制LoVo細胞中RhoA基因的表達;其中RhoA shRNA1干擾效果最佳。
　　 第三章 RNA干擾RhoA的表達對結直腸癌細胞株LoVo生物學行為的影響
　　 目的:研究RhoAshRNA對結直腸癌細胞株LoVo體外增殖、凋亡、遷移侵襲能力的影響,并初步探討其可能

7、的機理。
　　 方法:以成功構建的穩(wěn)定表達shRNA的LoVo-P1為研究對象,以未轉染的LoVo細胞、LoVo-P0為對照,繪制三組細胞的生長曲線比較生長差異,計算細胞倍增時間;MTT法比較三組細胞存活率的差異;細胞粘附實驗、劃痕實驗、Transwell小室檢測三組細胞體外侵襲力的變化。
　　 結果:未轉染的LoVo細胞、LoVo-P0組細胞的各項指標比較無明顯差異。與對照兩組的細胞比較,LoVo-P1組的細胞生長明顯

8、緩慢,從第四天開始生長速度明顯低于另外兩組,至對數生長期更明顯,生長曲線較平緩;LoVo-P1組的細胞的倍增時間31.24小時左右,延長約10小時。LoVo-P1組的細胞存活率明顯下降(P＜0.05)。LoVo-P1組的細胞的粘附力明顯下降(P＜0.05)。LoVo-P1遷移到劃痕區(qū)的細胞數明顯低于對照組(P＜0.05)。LoVo-P1穿過Matrigel濾膜的細胞數明顯低于對照組(P＜0.05)。
　　 結論:RhoA干擾質粒

9、P1穩(wěn)定轉染可抑制結腸癌細胞株LoVo的體外生長,使細胞倍增時間延長,抑制癌細胞的體外粘附、遷移侵襲能力。
　　 第四章 RNA干擾沉默RhoA基因對人結腸癌裸鼠皮下移植瘤的實驗研究
　　 目的:建立裸鼠皮下人結直腸癌種植瘤模型,研究RhoA基因沉默對結腸癌細胞株LoVo裸鼠成瘤的影響。
　　 方法:實驗細胞分為3組,即穩(wěn)定轉染RhoA shRNA的LoVo-P1組、未轉染的LoVo細胞組和轉染空載體的LoVo-

10、P0組。將各組結腸癌細胞直接接種于裸鼠皮下,觀察種植瘤的生長情況,4周后測量瘤體組織的體積和重量;免疫組化檢測腫瘤組織RhoA、VEGF、CD34(觀測微血管密度的變化)和MMP-2蛋白表達。
　　 結果:LoVo-P1組的腫瘤生長速度慢于其他兩組(P＜0.05)。實驗結束時瘤體組織的體積與瘤重明顯低于其他兩組(P＜0.05)。免疫組化證實LoVo-P1組的腫瘤組織RhoA、VEGF和MMP-2蛋白表達降低(P＜0.05),微血