脂肪酸合酶(FASN)表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理相關(guān)性研究及其對(duì)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景與目的：
　　脂肪酸合酶(Fattyacid synthase，F(xiàn)ASN)是脂肪酸生物合成過(guò)程中將小分子碳單位聚合成長(zhǎng)鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶，能夠調(diào)控內(nèi)源性脂肪酸的合成，其主要產(chǎn)物是軟脂酸，并且以甘油三酯的形式存儲(chǔ)能量，主要參與磷脂合成、細(xì)胞膜構(gòu)造、肺表面活性物質(zhì)生成、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)以及蛋白質(zhì)酰化等。眾多研究表明FASN在大部分正常組織中呈現(xiàn)不表達(dá)或僅微量表達(dá)，而在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)則明顯上調(diào)。目前有文獻(xiàn)報(bào)道FASN介導(dǎo)的物質(zhì)代

2、謝異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。人類(lèi)結(jié)直腸癌中FASN表達(dá)的差異是否與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為存在相關(guān)性需深入探究。本研究旨在探討FASN表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤臨床演進(jìn)及腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的相關(guān)性，以期進(jìn)一步闡明FASN與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，為結(jié)直腸癌的防治提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集臨床病理石蠟標(biāo)本及其臨床病理資料，用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)71例結(jié)直腸癌組織中FASN蛋

3、白的表達(dá)狀態(tài)，并分析其與結(jié)直腸癌病理類(lèi)型、臨床分期及預(yù)后的相關(guān)性;
　　2.收集臨床血漿標(biāo)本，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)74例結(jié)直腸癌患者血漿中FASN的濃度，分析其與結(jié)直腸癌病理類(lèi)型、臨床分期及預(yù)后的相關(guān)性;
　　3.Real-time定量檢測(cè)Caco-2、HT-29、LoVo和LS174T四種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中FASNmRNA的表達(dá)，篩選出FASNmRNA高表達(dá)細(xì)胞株作為靶細(xì)胞進(jìn)行RNAi。構(gòu)建pcDNATM6.2-GW/EmGF

4、P-miR重組干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒，測(cè)序鑒定，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，采用real-time定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)FASNmRNA的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)干擾效果，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，Real-time定量和Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中FASNmRNA和蛋白的表達(dá)水平。MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移能力的改變;
　　4.建立裸鼠移植瘤模型，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞株裸鼠體內(nèi)成瘤情況，移植瘤

5、組織H.E.染色，觀察腫瘤病理組織形態(tài);免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)移植瘤組織中FASN蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學(xué)（S-P法）結(jié)果顯示:56例結(jié)直腸癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)，占79％(其中38例陽(yáng)性，占54％;18例強(qiáng)陽(yáng)性，占25％);15例結(jié)直腸癌組織FASN蛋白陰性表達(dá)，占21％。在大多數(shù)癌組織中FASN蛋白的陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)烈，表現(xiàn)為彌漫性的細(xì)胞胞漿著色;在癌旁組織中的腺體細(xì)胞細(xì)胞漿中，可見(jiàn)少量FASN

6、蛋白的陽(yáng)性信號(hào);而在遠(yuǎn)端的腸組織中，未見(jiàn)FASN蛋白陽(yáng)性信號(hào)。潰瘍型癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率55％(22/40)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率35％(14/40);隆起型癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率52％(16/31)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率13％(4/31);兩組間FASN蛋白表達(dá)率有顯著差異(P=0.012)。高分化癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率20％(1/5)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率0％(0/5);中分化癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率71％(27/38)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)

7、率16％(6/38);低分化癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率36％(10/28)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率43％(12/28);三組間FASN蛋白表達(dá)率比較呈顯著差異(P＜0.05)。T1+T2期癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率36％(4/11)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率9％(1/11);T3+T4期癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率57％(34/60)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率28％(17/60);兩組間FASN蛋白表達(dá)率比較呈顯著差異(P=0.011)。無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移患者癌組織FASN

8、蛋白陽(yáng)性表達(dá)率63％(27/43)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率14％(6/43);有淋巴轉(zhuǎn)移患者癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率39％(11/28)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率43％(12/28);兩組間FASN蛋白表達(dá)率比較呈顯著差異(P=0.023)。無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率57％(36/63)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率19％(12/63);有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率25％(2/8)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率75％(6/8);兩組間FASN蛋白表達(dá)率比較

9、呈顯著差異(P=0.002)。臨床分期Ⅰ+Ⅱ期病人癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率52％（22/42），強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率17％(7/42);Ⅲ+Ⅳ期病人癌組織FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率55％((16/29)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率38％(11/29);兩組間FASN蛋白表達(dá)率比較呈顯著差異(P=0.020)。71例直結(jié)腸癌患者，根據(jù)癌組織中FASN蛋白表達(dá)陰性、陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性分為三組，隨訪發(fā)現(xiàn)總生存率:直結(jié)腸癌FASN陰性患者1年、2年、5年的生存率分別是86

10、.7％、79.4％、68.1％，平均生存期是47.0±5.5月;直結(jié)腸癌FASN陽(yáng)性患者1年、2年、5年的生存率分別是62.2％、48.1％、48.1％，平均生存期是34.1±4.3月，中位生存期是23.0月;直結(jié)腸癌FASN強(qiáng)陽(yáng)性患者1年、2年、5年的生存率分別是50.0％、36.8％、21.9％，平均生存期是23.1±5.2月，中位生存期是10.0±5.0月;三組間總生存率比較有顯著差異(P=0.025)。直結(jié)腸癌FASN陰性患者1

11、年、2年、5年的無(wú)病生存率分別是80.0％、64.6％、64.6％，平均無(wú)病生存期是42.6±6.3月;直結(jié)腸癌FASN陽(yáng)性患者1年、2年、5年的無(wú)病生存率分別是47.2％、39.9％、35.4％，平均無(wú)病生存期是26.9±4.3月，無(wú)病中位生存期是10.0±8.5月;直結(jié)腸癌FASN強(qiáng)陽(yáng)性患者1年、2年、5年的無(wú)病生存率分別是33.3％、20.8％、13.9％，平均無(wú)病生存期是15.2±4.7月，無(wú)病中位生存期是5.0±3.2月;三組

12、間無(wú)病生存率比較有顯著差異(P=0.010)。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌患者血漿FASN平均濃度為0.82±0.56units/L，健康人血漿FASN平均濃度為0.38±0.25units/L，兩組間有顯著差異(P=0.000)。T1+T2期患者血漿FASN平均濃度為0.57±0.22units/L，T3+T4期患者血漿FASN平均濃度為0.87±0.60units/L，兩組間有顯著差異(P=0.003)。有淋

13、巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血漿FASN平均濃度為1.14±0.68units/L，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血漿FASN平均濃度為0.62±0.35units/L，兩組間比較有顯著差異(P=0.001)。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者血漿FASN平均濃度為1.36±0.58units/L，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者血漿FASN平均濃度為0.75±0.52units/L，兩組間比較有顯著差異(P=0.002)。臨床分期Ⅰ+Ⅱ期患者血漿FASN平均濃度為0.62±0.36units/L;Ⅲ+

14、Ⅳ期患者血漿FASN平均濃度為1.12±0.68units/L，兩組間比較有顯著差異(P=0.000)。74例結(jié)直腸癌患者，血漿FASN平均濃度為0.82±0.56units/L，以0.82units/L為界值，將病人按血漿FASN濃度高于或低于界值分為兩組，隨訪5年，記錄無(wú)病生存時(shí)間及總生存時(shí)間，然后在兩組間進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示:低FASN血漿濃度直結(jié)腸癌患者1年、2年、5年的生存率分別是76.5％、65.0％、60.7％，平均生存

15、期是41.8±3.8月;高FASN血漿濃度直結(jié)腸癌患者1年、2年、5年的生存率分別是51.2％、39.6％、23.5％，平均生存期是24.6±4.2個(gè)月，中位生存期是14.0±4.9月;兩組間總生存率比較有顯著差異(P=0.003)。低FASN血漿濃度直結(jié)腸癌患者1年、2年、5年無(wú)病生存率分別是65.0％、53.5％、49.7％，平均無(wú)病生存期是35.0±4.1月，中位無(wú)病生存期是28.0月;高FASN血漿濃度直結(jié)腸癌患者1年、2年、5

16、年的無(wú)病生存率分別是35.5％、27.9％、20.0％，平均無(wú)病生存期是18.3±4.0月，中位無(wú)病生存期是6.0±2.4月;兩組間無(wú)病生存率比較有顯著差異(P=0.003)。
　　3.Real-time定量檢測(cè)結(jié)果顯示，四株結(jié)直腸癌細(xì)胞中，LS174T的FASN mRNA表達(dá)量最低，以其為對(duì)照，Caco-2、HT-29、LoVo、的FASN mRNA表達(dá)量分別為L(zhǎng)S174T的FASN mRNA表達(dá)量的56.11±15.35、28

17、.46±9.56、79.98±11.03倍。經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)，克隆中插入片段序列與設(shè)計(jì)的oligo序列完全一致，因此干擾載體構(gòu)建成功。用構(gòu)建成功的陰性干擾質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Caco-2、HT-29、LoVo細(xì)胞后，結(jié)果顯示Caco-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高，而LoVo及HT-29細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不佳，選取Caco-2細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用構(gòu)建成功的FASN干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，該干擾載體的基因沉默效果佳

18、，因此選用該質(zhì)粒建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)ASN干擾載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞后，下調(diào)了Caco-2細(xì)胞內(nèi)FASNmRNA和蛋白的表達(dá)水平。MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)FASN-RNAi下調(diào)了Caco-2細(xì)胞內(nèi)FASN的表達(dá)后，F(xiàn)ASN-RNAi組腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)96h后的OD值為0.74±0.11，克隆形成率為（5.83±1.93）％，培養(yǎng)24h后侵

19、襲細(xì)胞數(shù)量為95±9.46個(gè)細(xì)胞/200倍視野，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，F(xiàn)ASN-RNAi組腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力均明顯減低(P＜0.05)。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示:接種后的12只裸鼠，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照干擾質(zhì)粒Caco-2細(xì)胞組6只裸鼠全部成瘤，成瘤率為100％;轉(zhuǎn)染FASN干擾質(zhì)粒Caco-2細(xì)胞組6只裸鼠5只成瘤，成瘤率為83％。轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照干擾質(zhì)粒組裸鼠平均成瘤時(shí)間為10.2±1.9d，轉(zhuǎn)染FASN干擾質(zhì)粒組裸鼠平

20、均成瘤時(shí)間為12.8±1.3d，兩組平均成瘤時(shí)間間比較有顯著差異(P＜0.01)。種植后第18d時(shí)，陰性對(duì)照組腫瘤平均體積為284.68±115.50mm3，F(xiàn)ASN干擾組腫瘤平均體積為94.58±62.69mm3，組間平均體積比較有顯著差異(P＜0.01)。各腫瘤組織常規(guī)取材，H.E.染色后，可見(jiàn)移植瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞排列成條索狀、片狀，部分腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)小片壞死灶。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果所示，F(xiàn)ASN-RNAi組內(nèi)FASN蛋白的表達(dá)明顯低于

21、陰性對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.在結(jié)直腸癌癌組織中FASN呈高表達(dá)，結(jié)直腸癌患者血漿FASN水平顯著高于健康人血漿FASN水平。
　　2.在潰瘍型結(jié)直腸癌癌組織、中分化及低分化結(jié)直腸癌癌組織中FASN陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高于隆起型結(jié)直腸癌癌組織及高分化結(jié)直腸癌癌組織。
　　3.在腫瘤浸潤(rùn)范圍為T(mén)3+T4的、有淋巴轉(zhuǎn)移的、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的及臨床Ⅲ期+Ⅳ期的患者癌組織中的FASN陽(yáng)性表達(dá)率及血漿中的FASN

22、濃度顯著升高于T1+T2的、無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的以及臨床Ⅰ期+Ⅱ期的患者。
　　4.直結(jié)腸癌癌組織FASN陰性患者組及低血漿FASN濃度(＜0.82units/L)直結(jié)腸癌患者的總生存率及無(wú)病生存率均顯著高于直結(jié)腸癌癌組織FASN陽(yáng)性患者組及高血漿FASN濃度(＞0.82units/L)直結(jié)腸癌患者。
　　5.利用RNAi技術(shù)成功下調(diào)結(jié)直腸癌Caco-2細(xì)胞中FASN的表達(dá)后，細(xì)胞水平和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平的研究結(jié)果均顯示，F(xiàn)