HOTAIR 促進卵巢上皮性癌惡性生物學行為及其機制的研究.pdf

1、卵巢癌是繼宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌的三大惡性腫瘤之一，其病死率高居婦科惡性腫瘤之首，由于起病隱匿、早期缺乏特異性癥狀與體征及有效的醫(yī)學篩查手段，約70％卵巢癌患者就診時已發(fā)生局部或遠處轉(zhuǎn)移，失去了手術的最佳時期，結果導致5年的總體生存率欠佳。早期卵巢癌（Ⅰ期和Ⅱ期）的遠期生存率可達到80%～95%，相比之下，晚期卵巢癌（Ⅲ期和Ⅳ期）的遠期生存率只有10%～30%。因此卵巢惡性腫瘤存在“兩個70%”：超過70%的患者確診時已屬晚期；約70%的患

2、者在兩年內(nèi)復發(fā)。故由此可見,尋找早期診斷及有效的治療方法對于卵巢癌患者的生存率至關重要。近幾年,學者們一直在尋找具有特異性的方法,以提高卵巢癌的生存率,保證患者的有效預后。另外一種學說“二元論模型”認為，卵巢癌分為高級別和低級別兩類。高級別卵巢上皮性癌占卵巢癌發(fā)病的75%，占卵巢癌病死率的90%，其發(fā)病迅速，侵襲性極強，常伴發(fā)廣泛的盆腹腔轉(zhuǎn)移和種植，預后極差。而低級別卵巢上皮性癌發(fā)病緩慢，多經(jīng)歷良性、交界性和低度惡性的發(fā)展過程，多為早期

3、，預后較好。因此高級別卵巢上皮性癌由于極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，是威脅婦女健康的惡性腫瘤。然而其發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機制不明。
　　近來，繼miRNA的大量研究之后，被稱為長鏈非編碼 RNA(longnon-coding RNA，lncRNA）的一類分子量大于200nt的非編碼 RNA被發(fā)現(xiàn)并逐漸受到越來越多的研究。因其對靶基因表達的調(diào)控作用，lncRNA參與了許多癌癥發(fā)生、發(fā)展的過程。近年來的研究表明lncRNA參與了轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)修飾

4、、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)運輸多種重要的調(diào)控。(此處圖片省略）圖1 LncRNA的調(diào)控
　　我們的前期研究，對44例卵巢癌組織及14例正常卵巢組織樣本采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)的方法檢測長鏈非編碼RNA HOTAIR mRNA的表達。結果卵巢癌組織中HOTAIR mRNA表達高于正常卵巢組織〔（1.26士0.27 vs.（0.14士0.09）〕,差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)，病理類型為低度分化及未分化的卵巢癌組織中HOTAI

5、R mRNA表達高于中-低、中一高及高度分化組織﹝（1.65士0.41) vs（0.39士0.l4)﹞,差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05)。結論卵巢癌組織中HOTA IR的表達增高，且癌組織分化越低，HOTA IR表達越高。提示HOTA IR有可能作為發(fā)現(xiàn)卵巢癌，并判斷其惡性程度的一個分子標志，可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色。但機制不清。因此本研究擬在前期基礎上進一步研究Hotair在卵巢癌中的作用及其機制。為Hotair在卵巢

6、癌中的作用以及精準治療提供理論依據(jù)和基礎。
　　第一部分：HOTAIR促進卵巢上皮性癌惡性生物學行為及其機制的研究
　　目的：研究沉默HOTAIR后對上皮性卵巢癌惡性生物學行為的影響。
　　方法：
　?。?）qPCR檢測在HOTAIR在卵巢癌細胞株SKOV3,OVCAR3和A2780的表達情況。
　?。?）沉默HOTAIR后，劃痕實驗檢測卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移能力，transwell檢測卵巢癌細胞侵襲能力，EdU檢

7、測卵巢癌細胞增殖能力。
　　結果：
　?。?）HOTAIR在SKOV3和OVCAR3細胞中表達高于A2780細胞；
　　（2）沉默HOTAIR后，卵巢癌SKOV3細胞轉(zhuǎn)移、侵襲和增殖能力降低；
　　結論：
　　沉默HOTAIR可以抑制卵巢癌SKOV3細胞惡性生物學行為。
　　第二部分： HOTAIR通過miR-214和 miR-217調(diào)控PIK3R3參與卵巢癌惡性生物學行為
　　目的：
　

8、　探索HOTAIR影響卵巢癌惡性生物學行為的分子機制。
　　方法：
　?。?）生物信息學預測HOTAIR可能調(diào)控的ceRNA；
　　（2）qPCR檢測沉默HOTAIR后，PIK3R3的表達情況；同時檢測沉默PIK3R3后HOTAIR的表達情況；
　?。?）qPCR檢測沉默HOTAIR或PIK3R3后，miR-214和 miR-217表達情況；
　　（4）qPCR檢測miR-214和miR-217以及miR-

9、214和 miR-217 inhibitor對HOTAIR和PIK3R3的影響；
　?。?）雙熒光素酶報告基因檢測HOTAIR或PIK3R3是否是miR-214和 miR-217的直接靶點。
　?。?）免疫組化檢測PIK3R3在卵巢癌組織的表達情況；
　　（7）沉默PIK3R3后，檢測卵巢癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力。
　　結果：
　?。?）生物信息學預測HOTAIR和PIK3R3互為ceRNA，HOTAI

10、R和PIK3R3是miR-214和 miR-217的潛在靶點；
　?。?）沉默HOTAIR后，PIK3R3表達降低；沉默PIK3R3后，HOTAIR表達下調(diào)（P<0.05）；
　?。?）沉默HOTAIR或PIK3R3后，miR-214和 miR-217表達上調(diào)（P<0.05）；
　?。?）轉(zhuǎn)染miR-214和 miR-217 mimics后，HOTAIR或PIK3R3表達降低；轉(zhuǎn)染miR-214和 miR-217 in

11、hibitor后，HOTAIR或PIK3R3表達增加；
　?。?）和對照組比較，共轉(zhuǎn)染miR-214 mimics和pMIR-HOTAIR3’UTR后，熒光素酶活性明顯下降（P<0.05）；和對照組比較，共轉(zhuǎn)染miR-214 mimics和MIR-HOTAIR3’UTRm后，熒光素酶活性無明顯改變（P>0.05）；共轉(zhuǎn)染miR-217 mimics和pMIR-HOTAIR3’UTR后，熒光素酶活性明顯下降（P<0.05）；和對照組

12、比較，共轉(zhuǎn)染miR-217 mimics和MIR-HOTAIR3’UTRm后，熒光素酶活性無明顯改變（P>0.05）；
　?。?）免疫組化結果顯示，PIK3R3在卵巢漿液性癌和粘液性癌中表達高于正常卵巢組織；
　?。?）沉默PIK3R3后，SKOV3細胞增殖能力、轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力均受到抑制。
　　結論：
　　卵巢癌SKOV3細胞株沉默HOTAIR基因表達后，細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力降低；HOTAIR通過miR-

13、214和 miR-217靶向PIK3R3調(diào)控卵巢癌SKOV3細胞的惡性生物學行為。
　　第三部分：沉默HOTAIR影響SKOV3體內(nèi)成瘤能力
　　目的：
　　探究HOTAIR在體內(nèi)對卵巢癌SKOV3細胞生長的影響
　　方法：
　　（1）慢病毒載體構建HOTAIR沉默的穩(wěn)定細胞株，然后移植到裸鼠左側(cè)腋窩，觀察移植瘤生長情況；
　?。?）采用免疫組織化學檢測沉默HOTAIR基因后，裸鼠移植瘤中PIK3R3