miR-494對胰腺癌生物學行為的影響及機制研究.pdf

1、研究目的:
　　檢測miR-494在胰腺癌組織和細胞系中的表達,分析miR-494異常表達與胰腺癌臨床病理特性的臨床相關性;以胰腺癌細胞系AsPC-1,PANC-1為研究對象,證實miR-494對胰腺癌細胞增殖,周期,凋亡,侵襲轉移,化療敏感性等生物學特性的影響;進行miR-494與c-Myc和SIRT1相關性分析,明確miR-494靶向調控c-Myc和SIRT1;應用小片段干擾RNA(siRNA)技術抑制c-Myc與SIRT1基

2、因表達,通過研究小片段干擾后PANC-1細胞增殖,周期,凋亡,侵襲轉移等生物學特性的影響,進一步明確miR-494的作用機制是通過調控c-Myc和SIRT1實現(xiàn)。
　　研究方法:
　　實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測胰腺組(86例胰腺癌組織和41例正常胰腺組織)和胰腺癌細胞系(AsPC-1,Bxpc-3,PANC-1,SW1990,Miapaca-2)中miR-494的表達,分析miR-494的表達與胰腺癌臨床

3、病理學特征及其預后的相關性;以胰腺癌細胞系AsPC-1和PANC-1為研究對象,分別轉染miR-494類似物(miR-494mimics)和抑制劑(miR-494inhibitor),實時定量PCR檢測轉染后miR-494的表達,以確定轉染效果;MTT(二苯基溴化四氮唑藍)和平板克隆觀察上調miR-494后對胰腺癌細胞增殖的影響;蛋白免疫印跡(westernblot)檢測上調miR-494后細胞周期與凋亡相關基因P21,CyclinD1

4、,BAX,Bcl-2,P53蛋白的表達;流式細胞術檢測細胞周期變化和凋亡的變化;β-半乳糖苷酶染色(β-Galactosidasestaining,β-Gal)測定細胞衰老;Transwell檢測各組細胞遷移(Migration)和侵襲(Invasion)的影響,并用westernblot檢測遷移和侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達變化;采用MTT法檢測AsPC-1和PANC-1細胞經上

5、調miR-494后對5-氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他濱(Gemcitabine,GEM)化療敏感性的變化;免疫組織化學染色法和實時定量PCR檢測c-Myc和SIRT1在胰腺癌組織中的表達,用Graphpad軟件對miR-494與c-Myc和SIRT1基因表達進行相關性分析;westernblot檢測轉染miR-494mimics和miR-494inhibitor后c-Myc和SIRT1蛋白水平的變換,并對miR-494同c-Myc和SI

6、RT1蛋白表達進行相關性分析;利用生物信息學預測軟件(miRanda,miRDBandTargetScan)尋找miR-494與c-Myc和SIRT1的3'-非編碼區(qū)結合(3'-UTR)結合位點,構建c-Myc和SIRT1雙熒光報告基因質粒,通過雙熒光報告初步證實miR-494直接靶向c-Myc和SIRT1;為了進一步明確miR-494的作用機制,以PANC-1為研究對象,小片段干擾RNA(siRNA)技術抑制c-Myc為siRNA-c

7、-Myc,小片段干擾RNA(siRNA)同時抑制c-Myc與SIRT1為siRNA-c-Myc+siRNA-SIRT1(co-transfected,共轉染組),對照為siRNA-NC(normalcontrol),westernblot檢測轉染后c-Myc和SIRT1蛋白的變化,以確定轉染效果;MTT(二苯基溴化四氮唑藍)觀察各組對PANC-1細胞增殖的影響;蛋白免疫印跡(westernblot)檢測處理后細胞周期與凋亡相關基因P21

8、,CyclinD1,BAX,Bcl-2,P53蛋白的表達;流式細胞術檢測細胞周期變化和凋亡的變化;β-半乳糖苷酶染色(β-Galactosidasestaining,β-Gal)測定細胞衰老;Transwell檢測各組細胞侵襲(Invasion)的影響;BALB/c裸鼠成瘤實驗鑒定上調miR-494和干擾c-Myc后PANC-1細胞的成瘤能力,westernblot檢測瘤體c-Myc和SIRT1的表達變化。
　　實驗結果:

9、　　miR-494在胰腺癌組織的表達水平明顯低于正常胰腺組織(0.567±0.049vs1.000±0.104,P<0.001);同正常組織相比,miR-494在胰腺癌細胞系AsPC-1,Bxpc-3,PANC-1和SW1990中顯著下降,在AsPC-1(0.171±0.023vs1.060±0.131,p=0.0026)和PANC-1細胞(0.270±0.024vs1.060±0.131,p=0.004)中下降最為明顯;miR-494

10、高表達患者的生存時間明顯長于miR-494低表達患者(P=0.0366)。miR-494表達水平與胰腺癌患者年齡(p=0.0438)、腫瘤大小(p=0.0041)、TNM分期(p=0.0003)、淋巴侵襲(p=0.0010)、遠處轉移(p=0.0362)密切相關,而與腫瘤組織分化程度、患者性別、腫瘤部位、血管浸潤、神經侵犯無相關性(p>0.05)。由于胰腺癌細胞系AsPC-1和PANC-1的miR-494表達水平下降最為明顯,因此選取A

11、sPC-1和PANC-1作為實驗細胞系,轉染miR-494mimics后,miR-494表顯著上調(P<0.01),轉染miR-494inhibitor后miR-494下調(P<0.05),證實轉染有效。同各自的對照相比,轉染miR-494mimics后AsPC-1(45.13±5.38％,P<0.01)和PANC-1(41.42±3.95%,P<0.01)細胞增殖受到顯著抑制,轉染miR-494inhibitor后AsPC-1(23.

12、15±2.18%,P<0.05)和PANC-1(16.59±3.23%,P<0.05)細胞增殖增強。平板克隆結果顯示,轉染miR-494mimics后AsPC-1和PANC-1克隆數(shù)顯著降低。流式細胞檢測結果顯示上調miR-494后,同各自對照相比,AsPC-1(12.3±0.5%vs19.5±0.6%,P<0.05)和PANC-1細胞(8.9±0.8%vs17.1±0.3%,P<0.05)細胞凋亡增強,AsPC-1(63.3±3.1%

13、vs73.7±2.5%,P<0.05)和PANC-1細胞(40.5.6±4.2%vs58.6±3.7%,P<0.01)細胞周期G1期細胞比率顯著增加。同各自對照相比,上調miR-494后AsPC-1(17.5±2.1%vs40.7±1.7%,P<0.01)和PANC-1細胞(14.6±3.3%vs60.9±3.8%,P<0.01)衰老顯著增加。Westernblot檢測顯示經轉染miR-494mimics后Bcl-2和CyclinD1顯

14、著下調,乙?；痯53、BAX和p21顯著上調。Transwell檢測各組細胞侵襲和遷移能力發(fā)現(xiàn),上調miR-494后,AsPC-1和PANC-1細胞侵襲和遷移能力顯著減弱,侵襲相關蛋白MMP-2和MMP-9顯著下降。藥敏結果顯示,同各自的對照相比,在轉染miR-494后,AsPC-1細胞對5-FU(7.93±1.05vs27.56±2.89ug/mL,P<0.01)和GEM(17.5±1.39vs82.56±4.27ug/mL,P<0.

15、01)IC50值顯著下降,PANC-1細胞對5-FU(9.41±1.63vs42.62±3.16ug/mL,P<0.01)和GEM(25.33±1.75vs63.25±5.36ug/mL,P<0.01)的IC50也顯著下降,即上調miR-494后,AsPC-1和PANC-1對5-Fu和GEM的藥物敏感性明顯增強。免疫組織化學結果顯示,胰腺癌組織中c-Myc(52.74±1.534%vs26.49±1.56%,P<0.001)和SIRT1

16、(48.35±1.51%vs20.51±1.34%,P<0.001)陽性細胞數(shù)比率明顯高于正常組織。實時定量PCR顯示,同正常組織相比,胰腺癌組織中c-Myc(1.379±0.086vs0.940±0.070,P=0.0017)和SIRT1(1.583±0.0.110vs1.044±0.092,P=0.0022)基因高表達。胰腺組織中miR-494同c-Myc(r=-0.6799,P<0.001)和SIRT1(r=-0.5293,P<0

17、.001)基因表達負相關,提示miR-494可能調控c-Myc和SIRT1。生物信息學預測軟件(miRanda,miRDBandTargetScan)顯示,miR-494與c-Myc和SIRT1的3'-UTR有共同的結合位點,提示miR-494可能靶向c-Myc和SIRT1。轉染miR-494mimics后c-Myc和SIRT1基因和蛋白表達均顯著下調,轉染miR-494inhibitor后c-Myc和SIRT1基因和蛋白表達均上調。對

18、miR-494同c-Myc和SIRT1基因表達的相關性分析提示:miR-494同c-Myc(r=-0.6374,P=0.0142)和SIRT1(r=-0.5973,P=0.0239)負相關。miR-494mimics與包含野生型c-Myc或SIRT1的3'-UTR質粒共轉染的熒光活性明顯低于對照組,證實miR-494直接靶向c-Myc和SIRT1。轉染c-Myc干擾小片段后,c-Myc和SIRT1顯著下降(P<0.01),細胞增殖受抑制

19、,細胞G1期阻滯,細胞衰老增強,侵襲能力減弱(P<0.05)。然而siRNA-c-Myc組對細胞凋亡無明顯影響(P>0.05)。提示miR-494的作用不單純依賴c-Myc。共轉染c-Myc和SIRT1干擾小片段后,同單獨干擾c-Myc組相比,對增殖和侵襲抑制以及周期阻滯更為明顯(P<0.01)。另外,共轉染組組PANC-1細胞凋亡率增加(12.65±0.55%vs.16.85±0.75%,P=0.0457),凋亡和周期相關蛋白的結果同

20、上調miR-494結果一致。提示miR-494的作用是通過同時靶向c-Myc和SIRT1實現(xiàn)。BALB/c裸鼠成瘤實驗結果顯示上調miR-494后PANC-1細胞的成瘤能力下降(0.83±0.18vs0.32±0.07g,P<0.05)。Westernblot檢測瘤體c-Myc和SIRT1的表達下調。
　　實驗結論:
　　1.miR-494在胰腺癌組織中和胰腺癌細胞系的低表達,低表達miR-494與患者年齡,腫瘤大小,胰腺癌

21、侵襲轉移以及預后密切相關,檢測miR-494的表達有助于判斷胰腺癌惡性程度及預后。
　　2.上調miR-494在胰腺癌細胞AsPC-1和PANC-1細胞中的表達,可顯著抑制細胞增殖,增加凋亡和衰老細胞比例,發(fā)生G1期阻滯,減弱細胞侵襲和遷移能力,增強細胞對5-Fu和GEM的藥物敏感性。提示miR-494可能作為胰腺癌基因治療靶點。
　　3.c-Myc和SIRT1在胰腺癌組織中高表達,并與miR-494負相關。在PANC-1細

22、胞中,上調miR-494后,c-Myc和SIRT1表達下調;下調miR-494后,c-Myc和SIRT1上調;miR-494與c-Myc和SIRT1負相關。結合雙熒光結果,證實miR-494直接靶向c-Myc和SIRT1。
　　4.同時下調c-Myc和SIRT1在PANC-1細胞中的表達后,生物學效應及效應蛋白表達改變同上調miR-494一致;單一下調c-Myc后,凋亡未見明顯改變,且對細胞增殖抑制和周期阻滯較下調c-Myc和SI