地西他濱對CDX2基因表達(dá)及K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響.pdf

1、背景及目的：
　　急性白血病(acuteleukemia，AL)是一類原發(fā)于造血干細(xì)胞的惡性疾病。多種因素導(dǎo)致某一造血細(xì)胞系惡性增生，進(jìn)入血流并浸潤到組織和器官，從而引起貧血、出血、感染等一系列臨床表現(xiàn)。相關(guān)研究表明物理、化學(xué)、病毒、遺傳等因素均可能和白血病的發(fā)病有關(guān)。白血病發(fā)病中起主要作用的機(jī)制有原癌基因的轉(zhuǎn)化、抑癌基因畸變及細(xì)胞凋亡受抑等。
　　Wnt途徑通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、運(yùn)動和分化在胚胎發(fā)育過程中起重要作用。Wnt途

2、徑的異常激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、增殖，抑制細(xì)胞凋亡，研究表明90％的結(jié)直腸腫瘤可發(fā)現(xiàn)Wnt途徑的異常激活，同時(shí)，目前越來越多的證據(jù)表明Wnt通路的異常激活與造血系統(tǒng)惡性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，它可以促進(jìn)慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)及多發(fā)性骨髓瘤(MM)中惡性B淋巴細(xì)胞的增殖，可加速慢性粒細(xì)胞白血病(CML)由慢性期向加速期及急變期的轉(zhuǎn)變。同源盒基因(homeoboxgenes，Hoxgenes)，廣泛存在于生物體內(nèi)，在生物的發(fā)育和分化過程中

3、起重要作用。尾型同源盒基因CDX2(caudal type homebox transcription factor 2)在胚胎期發(fā)育過程中主要控制哺乳動物身體縱軸的分化和發(fā)育，是同原盒基因家族最重要一員。在正常成人體內(nèi)CDX2在腸道上皮及胰腺有表達(dá)，而在乳腺、前列腺、腎臟、肝臟、骨髓和外周血無表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道，90％的急性單核細(xì)胞白血病患者的白血病細(xì)胞中高表達(dá)CDX2基因。Scholl等人通過對急性白血病患者研究，證明了CDX2基因的異

4、常表達(dá)在惡性血液病中普遍存在。同時(shí)有研究表明，CDX2基因的表達(dá)受RA、Wnt和Fgf等通路的調(diào)控。Wnt通路的異常激活可導(dǎo)致CDX2基因的表達(dá)增高。近幾年對Wnt通路上游抑癌基因SFRPs的研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1、2、4、5啟動子中均含有CpG島結(jié)構(gòu)，且CpG島的頻繁甲基化導(dǎo)致的基因沉默可以激活Wnt信號通路從而促使白血病細(xì)胞抵抗凋亡。地西他濱做為去甲基化藥物，其抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用較強(qiáng)。地西他濱是否可以通過對Wnt通路上游基因的去甲

5、基化激活抑癌基因，從而在一定程度上關(guān)閉Wnt通路，下調(diào)CDX2基因的表達(dá)，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　本研究的目的是觀察地西他濱對CDX2基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)分析該藥在不同濃度下對白血病細(xì)胞系K562增殖及凋亡的影響，為該藥在臨床上用于治療白血病提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法：
　　1.WST-1法檢測細(xì)胞增殖抑制率:采用終濃度分別為0.02μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、1

6、0μmol/L、20μmol/L的地西他濱分別作用于K562細(xì)胞8h、16h、24h、32h，WST-1法檢測并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，根據(jù)增殖抑制率測得地西他濱作用的最佳時(shí)間及最佳濃度。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:采用終濃度為1μmol/L的地西他濱（最佳作用濃度）作用于處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞16h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀AnnexinV FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡率。
　　3.RT-PCR法檢測CDX2mRNA的

7、表達(dá):于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞中分別加入終濃度為0.02μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、20μmol/L的地西他濱，加藥16小時(shí)后應(yīng)用RT-PCR法檢測不同藥物濃度下CDX2mRNA表達(dá)水平的變化。
　　4.Western blot法檢測CDX2蛋白的表達(dá):分別加終濃度為0.2μmol/L、5μmol/L的地西他濱給處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，處理16小時(shí)后，用Western

8、blot法檢測各組CDX2蛋白的表達(dá)變化。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，用((x)±s)表示統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)置為α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.WST-1結(jié)果顯示:終濃度為0.02μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的地西他濱加藥16小時(shí)后，K562細(xì)胞增殖均

9、受到不同程度的抑制，抑制率分別為（29.6±0.35）％，（36.5±0.94）％，(54.4±1.11)％，(70.3±2.12)％，(81.1±2.65)％，(88.2±3.13)％，與空白對照組(1.5±0.09)％相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);不同濃度地西他濱組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。終濃度為1μmol/L的地西他濱加藥8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、32小時(shí)后，K562細(xì)胞增殖抑制率分別為（3

10、1.3±1.51）％，(54.4±1.11)‰(68.0±1.23)‰（68.8±1.28）％，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且作用8小時(shí)與16小時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但16小時(shí)與24、32小時(shí)的增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，故確定作用16小時(shí)為地西他濱作用的最佳時(shí)間點(diǎn)。軟件處理分析結(jié)果顯示地西他濱在16小時(shí)的IC50為0.784μmol/L，接近1μmol/L，故將該濃度確定為地西他

11、濱最佳作用濃度，進(jìn)行隨后的細(xì)胞凋亡以及CDX2蛋白表達(dá)變化的分析。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:當(dāng)1μmol/L的地西他濱作用于K562細(xì)胞16h后，AnnexinV FITC/PI雙染結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率為:（29.6±1.2）％，而對照組為（0.76±0.08）％，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示:終濃度為0.02μmol/L、0.2μmol/L、1μmo

12、l/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的地西他濱作用于K562細(xì)胞16小時(shí)后，CDX2mRNA表達(dá)水平分別為0.84±0.028，0.74±0.034，0.63±0.020，0.51±0.023，0.41±0.011，與空白對照組0.94±0.019相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);不同濃度地西他濱之間CDX2mRNA表達(dá)水平有顯著差異(P＜0.05)。終濃度為1μmol/L的地西他濱處理K562細(xì)胞16h