地西他濱對K562細胞增殖、凋亡及WAVE1基因表達的影響.pdf

1、背景與目的
　　慢性髓系白血病(Chronicmyeloidleukemia，CML)的急變期(blasticphase，BP)作為CML的終末階段，預后極差。臨床上約有95％CML患者檢測出染色體異常，其分子學基礎為bcr/abl融合基因。近來研究發(fā)現(xiàn)bcr/abl融合基因的甲基化與CML的發(fā)生、進展及預后密切相關。而CML與甲基化的關系主要表現(xiàn)在癌基因的低甲基化、抑癌基因的超甲基化及融合基因的超甲基化這三個方面。
　　抑

2、癌基因的高甲基化常常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，這使得應用去甲基化藥物治療腫瘤成為可能。去甲基化藥物地西他濱(Decitabine，DAC)是一種特異的DNA甲基化轉移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）抑制劑。既往研究著重于DAC在白血病中發(fā)揮去甲基化作用，從而達到治療目的。后來研究逐漸發(fā)現(xiàn)，DAC亦能夠參與JAK-STAT信號傳導路徑的活化，表明其可能通過其他途徑發(fā)揮促凋亡效應，但關于通過另外途徑的可能

3、作用基因，則研究較少。
　　WASP家族Verprolin同源蛋白1(WAVE1)是WSP家族成員，是一種新型的抗凋亡蛋白，目前已證實在WAVE1基因在急性白血病患者中高表達，在正常人群中低表達或不表達。WAVE1基因的表達異常與腫瘤的發(fā)生、腫瘤侵潤及腫瘤耐藥亦有著密切的關系。WAVE1能夠通過調控細胞周期、參與JAK-STAT信號轉導通路參與細胞凋亡途徑，發(fā)揮抗凋亡作用。目前，DAC對CML中耐藥基因表達是否存在影響的報道較少。

4、因此，本實驗選擇不同濃度的DAC作用于白血病K562細胞系，觀察其對K562細胞系的增殖抑制作用分化作用及對耐藥基因表達的影響。為DAC治療CML急變或是耐藥CML提供實驗室依據(jù)。
　　方法
　　1.WST-1測細胞增殖抑制率:采用終濃度分別為0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的地西他濱分別作用K562細胞12h、24h、48h、72h，確定地西他濱作用于細胞的適宜濃度與時間及IC50值

5、r>　　2.流式細胞術檢測細胞凋亡:用5μmol/L的地西他濱作用對數(shù)生長期的K562細胞48小時，應用流式細胞儀AnnexinVFITC/7ADD雙染色法檢測不同濃度地西他濱作用的K562細胞凋亡率。
　　3.流式細胞術檢測細胞周期:用5μmol/L的地西他濱作用于對數(shù)生長期的K562細胞48小時，應用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。
　　4.RT-PCR法檢測WAVE1mRNA的表達:用5μmol/L的地西他濱作用對數(shù)生長

6、期的K562細胞48小時，應用RT-PCR法檢測不同藥物濃度下WAVE1mRNA表達水平的變化。
　　5.Westernblot法檢測WAVE1蛋白及Bcl-2蛋白的表達:用5μmol/L的地西他濱作用對數(shù)生長期的K562細胞48小時，用Westernblot法檢測WAVE1蛋白及Bcl-2蛋白表達的變化。
　　6.流式細胞術檢測細胞分化:根據(jù)預實驗結果，選1μmol/L的地西他濱作用對數(shù)生長期的K562細胞24小時、48小

7、時及72小時后，應用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD71及CD33的表達變化。
　　7.觀察細胞形態(tài)學變化:分別用0.5μmol/L、1μmol/L及5μmol/地西他濱作用于對數(shù)生長期的K562細胞24小時，24小時后經(jīng)瑞氏染色，在油鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。
　　8.統(tǒng)計分析:采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗計量數(shù)據(jù)均采用(x)±SD表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較之間采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗

8、標準，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果
　　1.WST-1結果顯示:不同濃度的地西他濱對K562細胞的增殖均具有明顯的抑制作用。終濃度為0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的地西他濱分別處理K562細胞48h，均能抑制K562細胞的增殖，其增殖抑制率分別為（21.4±2.28）％，（30.4±1.06）％，(55.7±1.22)％，（63.2±1.84）％，而對照組為（3.8±0.9

9、2）％，實驗組依次與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;不同濃度的地西他濱組進行組間比較，差異也具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。5μmol/L地西他濱分別處理K562細胞24h、48h、72h增殖抑制率分別為（40.2±2.01）％，(55.7±1.22)％，(58.1±2.13)％，各組抑制率分別與同一時間段對照組（（1.7±0.75）％，（3.8±0.92）％，（6.2±2.16）％）比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.

10、01);組間比較5μmol/L的DAC作用K562細胞24h和48h，DAC對K562細胞的增殖抑制率（（40.2±2.01）％vs（55.7±1.22）％）差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但作用48h與72h對K562細胞的增殖抑制率((55.7±1.22)％vs（58.1±2.13）％）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由此計算出地西他濱處理K562細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50值)為4.82umol/L。由半數(shù)抑制濃度選擇5umo

11、l/LDAC作用48h為實驗組進行后繼實驗。
　　2.流式細胞術檢測凋亡顯示:5umol/L的地西他濱作用K562細胞48h后，細胞凋亡率為（43.80±3.77）％，與空白對照組（（2.29±0.41）％）相比，凋亡率明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3.細胞周期變化:5umol/L的地西他濱作用K562細胞48h后，實驗組G0/G1期細胞(59.83±1.47)％較對照組(51.29±2.35)％增加

12、，實驗組S期細胞（31.27±0.91）％較對照組(38.81±1.29)％下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.05)，而G2/M期細胞未見明顯改變（分別為（8.29±2.36）％，(7.93±2.15)％，P＞0.05)，表明地西他濱作用K562細胞后，細胞阻滯在G0/G1期。
　　4.PCR擴增結果顯示:5umol/L的地西他濱作用K562細胞48h后，WAVE1mRNA的表達明顯降低（0.17±0.051），與對

13、照組相比較（0.37±0.033），差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.westernblot結果顯示:DAC對K562細胞中WAVE1蛋白表達:5umol/L的地西他濱作用K562細胞48h后，WAVE1蛋白表達(0.48±0.049)明顯降低，與空白對照組（0.92±0.052）比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。DAC對K562細胞中Bcl-2蛋白表達:5umol/L的地西他濱作用K562細胞48h后，B

14、cl-2蛋白表達(0.36±0.039)明顯減低，與空白對照組（0.87±0.061）比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　6.細胞表面分化結果流式細胞儀分析細胞表面分化抗原檢測結果顯示，濃度為1μmol/L地西他濱作用K562細胞24h、48h及72h后，其CD71+(CD33+并CD33-)表達量分別為(93.0±2.16)％，(92.2±0.63)％，(91.6±1.27)％，與空白對照組(62.9±1.03％)

15、相比，表達量明顯增高，差異均具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而CD71+在不同時間組的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　7.K562細胞形態(tài)學變化:DAC作用24h后，空白對照組的細胞多呈圓形，核大，細胞質少。經(jīng)0.5μmol/L地西他濱處理的K562較對照組未見明顯改變，少數(shù)出現(xiàn)胞質增多，核型改變等細胞分化表現(xiàn)。經(jīng)1umol/L地西他濱處理的K562細胞出現(xiàn)細胞質增多，細胞核多偏向一側，細胞核呈腎形或是不規(guī)則形等細

16、胞分化表現(xiàn)。而經(jīng)5umol/L地西他濱作用的細胞則出現(xiàn)細胞體積變小，核固縮或是凋亡小體等細胞凋亡的表現(xiàn)。
　　結論
　　1.地西他濱能夠抑制K562細胞的增殖，其抑制作用具有時間和濃度依賴性。
　　2.地西他濱能將細胞阻斷在G0/G1期，促進細胞凋亡。
　　3.地西他濱能顯著下調K562細胞WAVE1mRNA及蛋白的表達，可能通過調節(jié)Bcl-2的表達有關。
　　4.不同劑量的地西他濱能夠發(fā)揮促凋亡作用或誘導