RNA干擾技術(shù)阻斷S期激酶相關(guān)蛋白2表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、腫瘤是一種細(xì)胞周期調(diào)控紊亂性疾病，其根本原因在于細(xì)胞的正性因子表達(dá)增強(qiáng)或負(fù)性因子表達(dá)減弱，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖、分裂，出現(xiàn)細(xì)胞生長失控。泛素蛋白酶體途徑通過降解細(xì)胞周期調(diào)控因子參與對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，在平衡細(xì)胞周期調(diào)控因子方面發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
　　 S期相關(guān)蛋白激酶2（S-phase kinase-associated protein2，Skp2）屬于泛素蛋白酶體系統(tǒng)的組成部分，通過其特異性接觸將各種底

2、物蛋白招募到泛素蛋白酶體進(jìn)行泛素化降解而參與細(xì)胞周期的調(diào)控。Skp2作為一種與細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)系密切的癌基因，參與調(diào)控抑癌基因p27kip1的表達(dá)。p27kip1是Cip/Kip家族（CDK-interacting protein/kinase inhibition protein）中的一員，是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，能阻滯細(xì)胞周期于G1期。Skp2和p27kip1通過影響白血病細(xì)胞的增殖、分化、凋亡參與白血病的進(jìn)程和預(yù)后。
　　

3、 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是目前最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。為此，我們采用RNAi技術(shù)，以Skp2為切入點(diǎn)，構(gòu)建了靶向Skp2的RNAi序列，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，研究Skp2基因水平下調(diào)后，白血病細(xì)胞株K562中p27kip1的表達(dá)情況，初步探討下調(diào)Skp2基因表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括以下兩部分：
　　

4、 第一部分：靶向Skp2特異性RNA干擾重組體的構(gòu)建及篩選
　　 目的：利用pGenesil1.1質(zhì)粒構(gòu)建靶向Skp2的短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）干擾重組體，并通過轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞篩選有效的干擾序列。
　　 方法：利用在線設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)三對(duì)針對(duì)Skp2的有短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA序列及一對(duì)非特異對(duì)照序列，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，再克隆至帶有U6啟動(dòng)子及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced Gr

5、een Fluorecence Protein，EGFP）的質(zhì)粒pGenesil1.1中，構(gòu)建重組體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定后，進(jìn)行測序分析。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將構(gòu)建成功的4組重組體轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞系K562。采用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效果；通過RT-PCR技術(shù)檢測各處理組Skp2 mRNA的變化，流式細(xì)胞法檢測Skp2蛋白表達(dá)情況，篩選出有效抑制Skp2表達(dá)的序列。實(shí)驗(yàn)分7組：①空白對(duì)照組（簡寫為CON組）

6、；②脂質(zhì)體lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑組（簡寫為LIP組）；③質(zhì)粒對(duì)照組（簡寫為KB組）；④陰性對(duì)照組pGenesil1.1-NC shRNA（簡寫為NC組）；⑤pGenesil1.1-Skp2 shRNA1質(zhì)粒組（簡寫為shRNA1組）；⑥pGenesil1.1-Skp2 shRNA2質(zhì)粒組（簡寫為shRNA2組）；⑦pGenesil1.1-Skp2 shRNA3質(zhì)粒組（簡寫為shRNA3組）。
　　 結(jié)果：

7、①酶切測序分析結(jié)果表明已成功構(gòu)建了能表達(dá)Skp2 shRNA的三組重組體pGenesil1.1-Skp2 shRNA及陰性對(duì)照pGenesil1.1-NC shRNA；②轉(zhuǎn)染后48h，利用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀證實(shí)轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染效率約40％；③Skp2shRNA下調(diào)Skp2 mRNA的表達(dá)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取Skp2 shRNA下調(diào)率最高的時(shí)間點(diǎn)，即轉(zhuǎn)染后48h，收集各處理組的K562細(xì)胞測定Skp2基因和蛋白表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果

8、顯示，CON組、NC組、LIP組及KB組之間Skp2 mRNA表達(dá)無明顯差異，Skp2 shRNA組Skp2 mRNA較NC組均顯著降低，其中shRNA1組下調(diào)率為40.00％，shRNA2組下調(diào)率為76.36％，shRNA3組下調(diào)率為56.36％；④Skp2 shRNA抑制Skp2蛋白表達(dá)：流式細(xì)胞儀分析，CON組、NC組、LIP組及KB組之間Skp2蛋白表達(dá)無明顯差異，shRNA組Skp2蛋白表達(dá)較NC組均顯著降低，shRNA1組下

9、調(diào)率為36.77％，shRNA2組下調(diào)率為67.25％，shRNA3組下調(diào)率為45.30％。Skp2 shRNA可顯著下調(diào)Skp2基因和蛋白的表達(dá)，故選取pGenesil1.1-Skp2 shRNA2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)論：利用質(zhì)粒載體pGenesil1.1可成功構(gòu)建Skp2的shRNA干擾重組體，且可成功轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞，其中pGenesil1.1-Skp2 shRNA2對(duì)Skp2的抑制效率較高。
　　 第二部分

10、：Skp2短發(fā)卡RNA干擾重組體對(duì)K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 目的：應(yīng)用Skp2 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，探討特異性阻斷Skp2表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法：應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，采用RT-PCR技術(shù)檢測Skp2 mRNA、p27kipl mRNA水平變化，流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后Skp2、p27kip1蛋白表達(dá)情況；采用顯微鏡觀察細(xì)胞的生長情況；采用四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl-th

11、iazolyl-tetrazolium，MTT）實(shí)驗(yàn)了解細(xì)胞增殖抑制情況；采用碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）單染法了解轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的改變。
　　 結(jié)果：①Skp2 shRNA抑制Skp2 mRNA表達(dá)：RT-PCR結(jié)果顯示Skp2 shRNA可顯著下調(diào)Skp2 mRNA的表達(dá)，且對(duì)Skp2 mRNA的下調(diào)從干擾后12h即出現(xiàn)，最高下調(diào)率出現(xiàn)在干擾后48h，為76.36％，但Skp2 shRNA

12、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)Skp2 mRNA的下調(diào)持續(xù)時(shí)間較短，72h后Skp2 mRNA水平有所回升；②Skp2 shRNA抑制Skp2蛋白表達(dá)：流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，Skp2 shRNA可顯著下調(diào)Skp2蛋白的表達(dá)，但出現(xiàn)蛋白下調(diào)的時(shí)間稍晚于Skp2 mRNA，最高下調(diào)率出現(xiàn)在干擾后48h，為67.25％，72h后蛋白表達(dá)有所回升；③Skp2 shRNA影響p27kip1表達(dá)：流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，CON組、LIP組、KB組和NC組之間p2

13、7kip1蛋白表達(dá)無明顯差異，Skp2 shRNA組p27kip1蛋白表達(dá)較NC組明顯上調(diào)（591.03±2.60 vs358.56±10.41），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最高上調(diào)率出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48h，為64.83％，轉(zhuǎn)染后72h p27kip1蛋白表達(dá)有所下調(diào)，并且p27kip1蛋白的表達(dá)與Skp2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.969，P=0.000）。RT-PCR結(jié)果顯示，各組間的p27kip1mRNA表達(dá)無明顯變化。以上說明在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)p

14、27kip1的表達(dá)；④Skp2 shRNA影響K562細(xì)胞周期分布：根據(jù)以上結(jié)果，選取Skp2蛋白下調(diào)率最高的時(shí)間點(diǎn)，即干擾后48h進(jìn)行細(xì)胞周期分布、細(xì)胞抑制率和細(xì)胞凋亡率的檢測。碘化丙啶單染法檢測表明，CON組、LIP組、KB組及NC組之間細(xì)胞周期分布基本一致，Skp2 shRNA組較NC組G0/G1期細(xì)胞所占比例增多（64.57±2.36％vs34.58±0.75％），S期細(xì)胞所占比例減少（29.78±4.92％vs47.65±1.

15、85％），G2/M期細(xì)胞所占比例減少（5.65±3.03％ vs17.40±1.01％），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；⑤Skp2 shRNA抑制K562細(xì)胞增殖：MTT實(shí)驗(yàn)表明，CON組、LIP組、KB組及NC組之間細(xì)胞抑制率無顯著差異，Skp2 shRNA組細(xì)胞抑制率較NC組顯著增高（85.43±2.83％ vs1.23±6.51％），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；⑥Skp2 shRNA促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡：碘化丙啶單染法檢測表明，CON組、LIP組、KB組及N

16、C組之間凋亡率無明顯差異，Skp2 shRNA組細(xì)胞凋亡率較NC組顯著增高（12.46±4.35％ vs0.34±0.08％），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且shRNA組在G0/G1峰之前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰位-凋亡峰。
　　 結(jié)論：在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Skp2 shRNA質(zhì)粒，可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)Skp2表達(dá)，并且可以抑制Skp2對(duì)p27kip1的泛素化降解作用，進(jìn)一步證實(shí)p27kip1的蛋白表達(dá)與Skp2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。與此