Survivin、Livin在Ⅱ期大腸癌中的表達及siRNA抑制HT-29中Livin基因表達的研究.pdf

1、第一部分、利用免疫組化SP法檢測了Survivin和Livin在Dukes’B期結(jié)直腸癌中的表達，著重探討了Survivin、Livin和患者臨床特征和生存的關(guān)系。 1、研究目的： 1.1 探討Dukes’B期結(jié)直腸癌組織中Survivin和Livin的表達情況。 1.2 探討Dukes’B期結(jié)直腸癌根治術(shù)后的高危復發(fā)因素；分析Survivin、Livin與Dukes’B期結(jié)直腸癌患者臨床特征及預后的關(guān)系。

2、 2、研究方法： 2.1收集1998年1月至1999年12月中山大學腫瘤防治中心初治Dukes’B期結(jié)直腸癌患者術(shù)后組織標本共81例，所有患者均行根治性手術(shù)，術(shù)后定期隨訪。所有患者均經(jīng)術(shù)后臨床病理分期為Dukes’B期。12例正常對照標本取自經(jīng)病理證實無腫瘤殘留的陰性切緣。 2.2免疫組化SP法檢測81例Dukes’B期結(jié)直腸癌組織及12例正常對照組織中Slarvivin和Livin的表達。 2.3利用統(tǒng)計學軟

3、件SPSS13.0分析兩種蛋白表達的相關(guān)性、與患者臨床特征的關(guān)系、與患者術(shù)后復發(fā)/轉(zhuǎn)移和生存的關(guān)系。 3、研究結(jié)果： 3.1在12例正常結(jié)直腸粘膜組織中僅1例檢測到Survivin蛋白弱陽性表達，2例Livin蛋白呈弱陽性表達。在8l例Dukes’B期結(jié)直腸癌組織中，Survivin的陽性表達率為58.0﹪(47/81)，Survivin主要表達于腫瘤細胞胞漿，胞核和胞膜也有輕度染色；Livin的陽性表達率為45.7﹪(

4、37/81)，其中弱陽性表達率為8.6﹪(7/81)，中度陽性表達率為13.6﹪(11/81)，強陽性表達率為23.5﹪(19/81)，Livin在腫瘤細胞細胞核及細胞漿中均有表達。Survivin、Livin在結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸粘膜中的表達差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)3.2 Survivin及Livin在：Dukes’B期結(jié)直腸癌組織中的表達與性別、腫瘤部位、腫瘤大小、T分期、大體類型、組織分化程度均無明顯相關(guān)性(均P>

5、0.05)；Survivin的表達與患者年齡有關(guān)，<50歲患者陽性率更高(P=0.003)；Survivin和Livin在有復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移患者中的表達較無復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移患者中的表達高，差異均有顯著性意義(P值分別為0.02和0.001)。 Livin和Survivin的表達不具相關(guān)性(P>0.05)。 3.3 Survivin陽性和陰性組的5年牛存率分別為63.8﹪和88.2﹪，log-rank檢驗顯示有顯著性差異(P=0.039)；L

6、ivin陽性和陰性組的5年牛存率分別為56.8﹪和90.9﹪，log-rank檢驗亦顯示有顯著性差異(P=0.001)； Survivin陽性和陰性組的5年無復發(fā)生存率分別61.7﹪和85.3﹪，log-rank檢驗顯示有顯著性差異(P=0.032)；Livin陽性和陰性組的5年無復發(fā)生存率分別為54.1﹪和86.4﹪，log-rank檢驗亦顯示有顯著性差異(P=0.002)。Cox多因素相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)T4(P=0.002)及Livin陽

7、性(P=0.047)是Dukes’B期結(jié)直腸癌的獨立不良預后因素。 4、結(jié)論： 4.1 Survivin與LiVin在Dukes’B期結(jié)直腸癌組織中表達明顯高于正常對照，兩者的表達不具相關(guān)性。 4.2 Survivin和Livin陽性表達患者更易復發(fā)/轉(zhuǎn)移，生存期更短。 4.3 Cox多素分析顯示T4和Livin表達，而非Survivin表達為Dukes’B期結(jié)直腸癌的獨立不良預后因素，提示Livin基因

8、可能在早期結(jié)直腸癌發(fā)病中較Survivin起更大作用。 第二部分 siRNA抑制HT-29細胞中Livin基因表達的實驗研究。 1 研究目的： 1.1篩選出有效抑制Livin基因表達的siRNA片斷。 1.2觀察siRNA抑制人結(jié)腸癌細胞系HT-29 Livin基因表達后對其生物學行為的影響。 2 研究方法： 2.1按照siRNA的合成原則，設(shè)計兩對siRNA分子，由上海吉瑪公司合成，分別

9、稱為siRNA-648和siRNA-1273，合成后在Genebank中進行BLAST，排除與其他基因同源。利用轉(zhuǎn)染試劑RNAi-mate分別轉(zhuǎn)染入HT-29細胞。 2.2在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分別檢測siRNA轉(zhuǎn)染后對HT-29細胞中Livin基因的抑制作用，篩選有效的序列進行下一步實驗。觀察siRNA不同時間點和不同濃度對Livin的抑制作用。 2.3 siRNA轉(zhuǎn)染后對HT-29細胞生物學行為的影響：采用流式細

10、胞儀測定轉(zhuǎn)染siRNA分子48h后HT-29細胞凋亡率和細胞周期的變化；測定轉(zhuǎn)染后48h Caspase-3活性的變化；利用MTT法測定siRNA與常用治療腸癌藥物5-FU、CPT-11、Oxaliplatin共同作用對HT-29細胞半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)的影響，計算增敏倍數(shù)。 2.4將HT-29細胞與CPT-11、5-FU、Oxaliplatin共孵48h，了解對Livin基因表達是否有影響，初步探討siRNA和化療藥

11、物協(xié)同作用的機制。 3 研究結(jié)果： 3.1 RNAi-mate可有效地將siRNA分子轉(zhuǎn)染至HT-29細胞內(nèi)；siRNA-648在37.5nM、75nM、150HM及300nM濃度下對Livin基因均有抑制作用，而siRNA-1273在上述各濃度下均對Livin基因無明顯抑制作用；150nM濃度的siRNA轉(zhuǎn)染HT-29細胞后24h在mRNA和蛋白質(zhì)水平均觀察到Livin表達受抑，48h抑制程度最明顯，而96h后Livi

12、n表達開始恢復，144h后Livin mRNA基本恢復至轉(zhuǎn)染前水平。 3.2轉(zhuǎn)染siRNA-648后HT-29細胞周期發(fā)生改變，G1期細胞比例升高而S期細胞比例下降；HT-29細胞凋亡率升高(2.4±0.5﹪vs 16.5±2.8﹪，P<0.05)；Livin基因抑制后細胞Caspase-3活性明顯增加(0.160±0.023 vs 0.347±0.058，P<0.05)。 3.3單用5-FU、CPT-11、Oxalip

13、latin時，三藥的IC50分別為1.87ug/mL、4.43ug/mL及1.04μg/mL；當先利用siRNA-648抑制Livin基因后，三藥的IC<,50>分別為1.16ug/mL、1.96 ug/mL及0.36 ug/mL，siRNA-648和3種化療藥物均具有明顯增效作用，增敏倍數(shù)分別為1.61、2.26和2.61。 3.4 HT-29與CPT-11、5-FU、Oxaliplatin共孵48h后，Livin的基因表達并

14、無明顯改變，提示siRNA-648通過其他方式與化療藥物產(chǎn)生增效作用。 4 結(jié)論： 4.1siRNA-648能有效抑制Livin基因的表達，伴隨著細胞凋亡增加和細胞周期重新分布及Caspase-3活性增加；siRNA與5-FU、CPT-11及Oxaliplatin均具協(xié)同作用，Livin基因可能是結(jié)直腸癌的潛在的治療靶點。 4.2HT-29與化療藥物共孵后Livin基因并無變化，提示其與siRNA-648的協(xié)同作