人源性大腸癌cDNA噬菌體表達文庫的構建及大腸癌相關抗原的SEREX篩選.pdf

1、中英文壤寫鍵慰照浚打下基礎。材料與方法1cDNA的合成：術中取新鮮大腸癌組織標本，用TrizolLSReagent試劑提取總RNA，用RTPCR反轉錄合成cDNA第1鏈，用LD—PCR合成eDNA第2鏈，第2鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K消化后，用蹄I酶切，經(jīng)C11IomaSpin一400柱子過柱除去小于500bp的小片段。2cDNA與^T咖IEx2噬菌體連接：cDNA與去磷酸化的九TriplEx2噬菌體左、右臂連接，連接產物進行體外包裝反應，再

2、轉化EcoliXLl一blue大腸桿菌，構建成eDNA噬菌體表達文庫。3文庫的質量鑒定：指標為滴度、重組率、cDNA片段大小。文庫按不同濃度稀釋，轉化EcoliXLlblue大腸桿菌感受態(tài)細胞，滴定文庫的滴度，確定文庫容量大小。用ITPG誘導和X—gal顯色測定重組率。用PCR方法和蹄I酶切鑒定文庫的重組噬菌體插入的外源cDNA片段大小。4SEREX篩選：又稱重組克隆表達抗原的血清學鑒定技術。首先構建大腸癌cDNA表達文庫，然后用大腸癌

3、患者血清進行免疫篩選，進一步鑒定陽性克隆的特性。5大腸癌患者血清預吸收：制備EcoliXLlBlue大腸桿菌感受態(tài)細胞，制備大腸桿菌EcoliXLlblue裂解液，對大腸癌患者血清中抗大腸桿菌EcoliXLlblue抗體的進行預吸收，以消除篩選中的假陽性結果。6SEREX篩選過程：大腸癌cDNA文庫鋪90mm培養(yǎng)皿，準備文庫克隆。見噬斑長出后，用預先20mmol／LIPTG溶液浸泡的硝化纖維素膜(Nc膜1，42。C誘導4小時轉膜，剝膜后

4、進行免疫反應，用大腸癌患者血清作一抗，用堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG抗體作二抗，以氮藍四唑(NBT)和5’一溴一4’一氯一3’吲哚磷酸(BCIP)進行顯色反應，深藍色噬斑為陽性克隆。7陽性克隆鑒定：陽性克隆用150mm平板擴增，用Qiagen公司的^一DNA試劑盒提取純化噬菌體DNA，用PCR鑒定陽性克隆cDNA片段大小。8陽性克隆測序分析：陽性克隆eDNA用Pfu高保真酶做PCR，PCR產物克隆到pUCm—T載體做T一克隆，進行測序。