人源性大腸癌cDNA噬菌體表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建及大腸癌相關(guān)抗原的SEREX篩選.pdf

1、中英文壤寫(xiě)鍵慰照浚打下基礎(chǔ)。材料與方法1cDNA的合成：術(shù)中取新鮮大腸癌組織標(biāo)本，用TrizolLSReagent試劑提取總RNA，用RTPCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，用LD—PCR合成eDNA第2鏈，第2鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K消化后，用蹄I酶切，經(jīng)C11IomaSpin一400柱子過(guò)柱除去小于500bp的小片段。2cDNA與^T咖IEx2噬菌體連接：cDNA與去磷酸化的九TriplEx2噬菌體左、右臂連接，連接產(chǎn)物進(jìn)行體外包裝反應(yīng)，再

2、轉(zhuǎn)化EcoliXLl一blue大腸桿菌，構(gòu)建成eDNA噬菌體表達(dá)文庫(kù)。3文庫(kù)的質(zhì)量鑒定：指標(biāo)為滴度、重組率、cDNA片段大小。文庫(kù)按不同濃度稀釋?zhuān)D(zhuǎn)化EcoliXLlblue大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，滴定文庫(kù)的滴度，確定文庫(kù)容量大小。用ITPG誘導(dǎo)和X—gal顯色測(cè)定重組率。用PCR方法和蹄I酶切鑒定文庫(kù)的重組噬菌體插入的外源cDNA片段大小。4SEREX篩選：又稱(chēng)重組克隆表達(dá)抗原的血清學(xué)鑒定技術(shù)。首先構(gòu)建大腸癌cDNA表達(dá)文庫(kù)，然后用大腸癌

3、患者血清進(jìn)行免疫篩選，進(jìn)一步鑒定陽(yáng)性克隆的特性。5大腸癌患者血清預(yù)吸收：制備EcoliXLlBlue大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，制備大腸桿菌EcoliXLlblue裂解液，對(duì)大腸癌患者血清中抗大腸桿菌EcoliXLlblue抗體的進(jìn)行預(yù)吸收，以消除篩選中的假陽(yáng)性結(jié)果。6SEREX篩選過(guò)程：大腸癌cDNA文庫(kù)鋪90mm培養(yǎng)皿，準(zhǔn)備文庫(kù)克隆。見(jiàn)噬斑長(zhǎng)出后，用預(yù)先20mmol／LIPTG溶液浸泡的硝化纖維素膜(Nc膜1，42。C誘導(dǎo)4小時(shí)轉(zhuǎn)膜，剝膜后

4、進(jìn)行免疫反應(yīng)，用大腸癌患者血清作一抗，用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體作二抗，以氮藍(lán)四唑(NBT)和5’一溴一4’一氯一3’吲哚磷酸(BCIP)進(jìn)行顯色反應(yīng)，深藍(lán)色噬斑為陽(yáng)性克隆。7陽(yáng)性克隆鑒定：陽(yáng)性克隆用150mm平板擴(kuò)增，用Qiagen公司的^一DNA試劑盒提取純化噬菌體DNA，用PCR鑒定陽(yáng)性克隆cDNA片段大小。8陽(yáng)性克隆測(cè)序分析：陽(yáng)性克隆eDNA用Pfu高保真酶做PCR，PCR產(chǎn)物克隆到pUCm—T載體做T一克隆，進(jìn)行測(cè)序。