肝細(xì)胞肝癌血管浸潤(rùn)相關(guān)的microRNA、lncRNA篩選及功能研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。雖然臨床上可采用的治療方案有很多，但HCC患者的5年生存率仍然很低。血管侵犯是HCC復(fù)發(fā)的主要預(yù)測(cè)指標(biāo)，與腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散相關(guān)，提示預(yù)后不良。目前腫瘤血管侵犯難以通過(guò)手術(shù)前影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，只能在手術(shù)切除樣本的病理檢查中被發(fā)現(xiàn)，限制了對(duì)手術(shù)決策的影響。針對(duì)HCC的血管侵犯已有很多研究。術(shù)前血清甲胎蛋白、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小和體積均被證明

2、與血管侵犯密切相關(guān)。血清和腫瘤中的生物標(biāo)記物也開(kāi)始被用于評(píng)估血管浸潤(rùn)。MicroRNAs（miRNAs）是指影響眾多生理和病理過(guò)程的微小非編碼調(diào)控RNA分子。MiRNAs結(jié)合于目標(biāo)RNA的3′-非編碼區(qū)（untranslated region，UTR），抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)其降解。很多miRNAs被認(rèn)為可作為HCC血管浸潤(rùn)的生物標(biāo)記物。長(zhǎng)編碼RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）包含超過(guò)200個(gè)核苷酸，但

3、不具備蛋白編碼功能。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs參與細(xì)胞中多種不同的生物過(guò)程，如轉(zhuǎn)錄、拼接、翻譯、復(fù)制、染色體形成和翻譯后的蛋白修飾，進(jìn)而影響細(xì)胞分化、發(fā)育、免疫反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡等。但是，相比編碼基因來(lái)說(shuō)，失調(diào)的lncRNAs在HCC進(jìn)展和惡化過(guò)程中的作用及其臨床意義一直未被闡明。雖然miRNAs和lncRNAs被認(rèn)為與血管侵犯相關(guān)，但是缺乏進(jìn)一步的基因組分析的證據(jù)?；蛐酒透咄繙y(cè)序依賴上千的生物信息，為HCC基因改變提

4、供準(zhǔn)確的遺傳全景。研究者可以通過(guò)這些技術(shù)檢測(cè)HCC中大量基因的表達(dá)變化，診斷HCC血管浸潤(rùn)。癌癥基因組計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）提供的大量遺傳和分子信息數(shù)據(jù)，包括IlluminaHiSeq_RNASeq和IlluminaHiSeq_miRNASeq測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序數(shù)據(jù)，各個(gè)樣本均含有相應(yīng)的RNA-seq和miRNAseq數(shù)據(jù)，研究者可以綜合分析與腫瘤特征相關(guān)的遺傳和分子改變。
　　方法：建立基于

5、多種miRNA的生物模型用于預(yù)測(cè) HCC血管浸潤(rùn)。LASSO（least absolute shrinkage and selection operator method）模型是一種適用于高維微陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。我們采用 TCGA的miRNA和lncRNA數(shù)據(jù)，運(yùn)用 LASSO-Logistic回歸構(gòu)建模型。此外，我們?cè)u(píng)估了模型對(duì)HCC預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。應(yīng)用受試者工作特征曲線面積(area under receiver operati

6、ng characteristic curve，AUC)評(píng)估其血管浸潤(rùn)預(yù)測(cè)能力，以一致性指數(shù)（concordance index，C-index）和時(shí)間依賴受試者工作特征曲線(time-dependent receiver operating characteristic，td-ROC)分析其預(yù)后評(píng)估價(jià)值。此外，應(yīng)用外部獨(dú)立HCC群體對(duì)該生物模型血管浸潤(rùn)的預(yù)測(cè)和預(yù)后判斷能力的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證檢測(cè)miRN

7、A對(duì)HCC的作用。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)中RNA-seq轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行l(wèi)ncRNA注解，篩選血管浸潤(rùn)相關(guān)lncRNA后，建立基于多種lncRNA的生物模型用于判斷HCC血管浸潤(rùn)，并分析其對(duì)HCC的預(yù)后價(jià)值。使用方法同第一部分。結(jié)合兩部分研究結(jié)果，構(gòu)建 HCC血管浸潤(rùn)相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。此外，通過(guò)HNF1A-AS1-silencer轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞進(jìn)一步研究HNF1A-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖侵襲的作用。RNA結(jié)合位點(diǎn)分析篩

8、選HNF1A-AS1結(jié)合的miRNA，并用雙螢光素酶驗(yàn)證。
　　結(jié)果：在納入研究的HCC患者中，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)有106名（106/361,34.6％）和驗(yàn)證組有46名(46/127,36.2%)發(fā)生血管浸潤(rùn)。性別（P=0.115）、年齡（P=0.227）、TNM T分級(jí)（P=0.902）、AJCC病理分級(jí)（P=0.429）和血管浸潤(rùn)（P=0.754）在TCGA的數(shù)據(jù)和驗(yàn)證組中無(wú)顯著差異。在TCGA數(shù)據(jù)1046個(gè)miRNAs中，有2

9、7個(gè)miRNAs在血管浸潤(rùn)和非血管浸潤(rùn)樣本中存在顯著差異，其中19個(gè)miRNAs上調(diào)，8個(gè)下調(diào)。采用LASSO法，有16種miRNA是非零回歸系數(shù)。LASSO分析產(chǎn)生的回歸系數(shù)用于16種miRNAs的權(quán)重并由此建立基于多個(gè)miRNAs的生物模型。該模型血管浸潤(rùn)危險(xiǎn)評(píng)分=-1.06+0.088×E_miR-452-5p-0.071×E_miR-378c+0.020×E_miR-9-5p+0.069×E_miR-550a-5p+0.167×

10、E_miR-15a-5p+0.364×E_miR-140-5p-0.059×E_let-7g-5p-0.246×E_miR-152-3p-0.026×E_miR-122-5p+0.173×E_miR-212-3p-0.218×E_miR-23b-3p+0.013×E_miR-365a-3p-0.035×E_miR-629-5p+0.038×E_miR-1270-0.256×E_miR-659-3p+0.054×E_miR-3941，其中

11、E_miRNA= Log2(miRNA表達(dá)值)。根據(jù)ROC曲線結(jié)果，該模型在TCGA組（AUC=0.731，95% CI：0.678–0.780）和驗(yàn)證組（AUC=0.727，95% CI：0.641–0.802）中均有較高的準(zhǔn)確性。該模型用于預(yù)測(cè)TCGA組和驗(yàn)證組血管侵犯的最適截?cái)嘀捣謩e為-0.54和1.73，靈敏度分別為61.3（95%CI：51.4-70.6）和63.0（95%CI：47.5-76.8），特異性分別為76.5（95

12、%CI：70.0-82.2）和75.3（95%CI：64.5-84.2）。多因素分析發(fā)現(xiàn)AJCC病理分級(jí)（HR：1.97，95% CI：1.36-2.85，P＜0.001）和miRNAs生物模型（HR：2.26，95% CI：1.56-3.29；P＜0.001）為總體生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而miRNAs生物模型不是腫瘤復(fù)發(fā)或無(wú)瘤生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。校正曲線和td-ROC分析表明該模型對(duì)TCGA組和驗(yàn)證組中HCC患者的1年、3年、5年總體生

13、存率具有良好的預(yù)后準(zhǔn)確性。根據(jù)臨床病例危險(xiǎn)因素（腫瘤分級(jí)和分期）分類后， miRNAs生物模型仍然具有臨床和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的預(yù)后模型。結(jié)合該分類器和腫瘤分期可為肝癌患者提供更準(zhǔn)確的1年、3年、5年總體生存率預(yù)測(cè)。因此，基于miRNA生物模型可為HCC患者預(yù)后評(píng)估提供幫助。通過(guò)在HepG2和HCCLM3細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-23b，qRT-PCR檢測(cè)miR-23b預(yù)測(cè)的靶基因（ATP6V1E1、CHST7、GCNT2、LHFPL2、MAPRE1

14、、RBPMS2、SETD8、SUCO和TOX）的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-23b類似物的HepG2和HCCLM3細(xì)胞系中RBPMS2顯著下降。同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-23b模擬物后，抑制細(xì)胞增殖和侵襲。通過(guò)ENSEMBL hg18和hg19比對(duì)及注釋，篩選出1490個(gè)lncRNA，其中有38個(gè)lncRNAs在血管浸潤(rùn)和非血管浸潤(rùn)樣本中存在顯著差異。使用LASSO-Logistic回歸方法，我們構(gòu)建了一個(gè)基于13種lncRNA

15、s的生物模型判斷HCC血管浸潤(rùn)的風(fēng)險(xiǎn)。模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=-2.45+0.056×E_LINC01356+0.006×E_LINC00202-1+0.030×E_MAPKAPK5-AS1+0.028×E_FLJ21408+0.043×E_CTC-459F4.3+0.049×E_AC062029.1+0.009×E_MIR4435-2HG+0.090×E_AC007405.4+0.075×E_XXbac-B135H6.15+0.060×E_FA

16、M13A-AS1-0.015×E_SLC25A5-AS1+0.020×E_RP11-14N7.2+0.097×E_HNF1A-AS1，其中E_lncRNA= Log2(lncRNA的表達(dá)值)。該模型在TCGA組（AUC=0.723，95%CI：0.669-0.773）和驗(yàn)證組（AUC=0.799，95%CI：0.726-0.859）中均有較高的血管浸潤(rùn)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，其最佳截?cái)嘀捣謩e為-0.69和-6.92，靈敏度分別為69.23(95%C

17、I：59.4-77.9)和61.22(95%CI：46.2-74.8)，特異性分別為63.50(95%CI：56.4-70.2)和85.71(95%CI：76.4-92.4)。多因素分析結(jié)果表明，腫瘤分期（HR：2.37，95%CI：1.71-3.27，P＜0.001）和lncRNAs生物模型（HR：1.57，95%CI：1.13-2.17，P=0.007）是HCC復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但是該模型不是總體生存和無(wú)瘤生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。根據(jù)

18、校正曲線和td-ROC結(jié)果，該模型能較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)TCGA組和驗(yàn)證組中HCC患者的1年、3年和5年的復(fù)發(fā)。我們將肝癌患者按臨床病理危險(xiǎn)因素（腫瘤分級(jí)和分期）分組， lncRNAs模型仍能區(qū)分高危險(xiǎn)組和低危險(xiǎn)組。結(jié)合模型和腫瘤分期，能更準(zhǔn)確預(yù)測(cè)1年、3年和5年腫瘤復(fù)發(fā)。根據(jù)兩部分結(jié)果，構(gòu)建了肝癌血管浸潤(rùn)相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)HNF1A-AS1可能與miR-122存在相互作用。在肝癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染HNF

19、1A-AS1 silencer后抑制細(xì)胞增殖和侵襲。細(xì)胞HNF1A-AS1抑制表達(dá)后引起miR-122靶基因ADAM17表達(dá)下降。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中也證實(shí)HNF1A-AS1的表達(dá)與ADAM17表達(dá)成正相關(guān)。
　　結(jié)論：通過(guò)TCGA大樣本遺傳和分子信息數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出HCC血管浸潤(rùn)相關(guān)的miRNA和lncRNA；構(gòu)建的miRNA和lncRNA生物模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)HCC血管浸潤(rùn)。此外，我們構(gòu)建了HCC血管浸潤(rùn)lncRNA-miRNA-mRN