Sirtuins與肝細(xì)胞癌預(yù)后及浸潤(rùn)性γδT細(xì)胞功能缺陷的關(guān)系研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是危害我國(guó)人民健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，在西方國(guó)家的發(fā)病率近年來(lái)呈增高趨勢(shì)。全球每年60多萬(wàn)人死于肝癌，其中50％發(fā)生在中國(guó)。如今臨床上手術(shù)治療仍然是治療肝癌的主要手段，但術(shù)后較高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率成為提高肝癌遠(yuǎn)期療效的主要障礙。為了解決這一棘手難題，很多研究從肝癌細(xì)胞的角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)了眾多與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的基因，并且針對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行抗腫瘤治療，但遺憾的是均未達(dá)到理想的干預(yù)效果。近年來(lái)，腫瘤微環(huán)境日益?zhèn)涫荜P(guān)注，從這個(gè)角度出發(fā)

2、研究各種免疫干預(yù)手段，嘗試調(diào)整或改變腫瘤免疫反應(yīng)狀態(tài)，以期發(fā)現(xiàn)干預(yù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的有效途徑[1]。目前，雖然很多針對(duì)免疫微環(huán)境的機(jī)制尚未闡明，然而已經(jīng)出現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者對(duì)局部免疫反應(yīng)的有效應(yīng)答，并且改善了臨床疾病進(jìn)展程度，有的方法甚至提高了患者的生存率[2]。
　　T淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要組成成員。T淋巴細(xì)胞大體上可以分為αβT細(xì)胞（T細(xì)胞受體雙肽鏈由α鏈及β鏈構(gòu)成）和γδT細(xì)胞（T細(xì)胞受體雙肽鏈則由γ鏈及δ鏈構(gòu)成）。前者主

3、要包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NKT細(xì)胞(Nature killT cells;NK T cells)、輔助性T細(xì)胞（Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞），由于其數(shù)量和分布優(yōu)勢(shì)備受關(guān)注，免疫效應(yīng)的研究也不斷深入[3-5]。后者則由于分布局限（外周血中所占比例不超過(guò)成熟T細(xì)胞總數(shù)的10％），認(rèn)識(shí)程度不足。但是近來(lái)發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞在肝臟中特殊富集，局部浸潤(rùn)數(shù)目可達(dá)T細(xì)胞總數(shù)的35％，并且在肝臟中發(fā)揮了不可忽視的免疫監(jiān)視作用[6]。
　　γδ

4、T細(xì)胞是一組較為特殊的T細(xì)胞亞群，兼有固有免疫和特異性免疫雙重特征，具有殺傷和調(diào)節(jié)雙重功能，在局部免疫穩(wěn)態(tài)的維持上發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7]。概括地講，首先由于T細(xì)胞受體多態(tài)性有限，能激活不依賴抗原遞呈細(xì)胞，而且不受主要組織相容性抗原限制，是固有免疫的重要組成部分;次之，本身能發(fā)揮抗原遞呈作用，為幼稚型αβT細(xì)胞的增殖、分化及活化提供共刺激信號(hào)，從而介導(dǎo)特異性免疫的誘導(dǎo)、活化[8];另外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中亦表明γδT細(xì)胞可通過(guò)直接殺瘤作用、早期大量分

5、泌IFN-γ及抑制αβT細(xì)胞中的促癌細(xì)胞成分來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[9]。此外，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)γδT細(xì)胞能以T細(xì)胞受體(T cellreceptor;TCR)依賴/非依賴方式殺傷多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞，并且磷酸化抗原能有效地刺激γδT細(xì)胞增殖與活化，增強(qiáng)其殺傷腫瘤細(xì)胞的效率[10-14]。這些證據(jù)表明γδT細(xì)胞在組織中可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
　　針對(duì)這群亞群細(xì)胞--γδT細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的角色及作用特點(diǎn)，我們前期研究了γδT細(xì)胞在

6、肝細(xì)胞癌中的免疫狀態(tài)及與其他免疫細(xì)胞間的相互作用。發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞在外周血中比例較低，但在肝臟中大量浸潤(rùn)，而肝細(xì)胞癌中浸潤(rùn)卻較癌旁肝組織中明顯降低;肝細(xì)胞癌浸潤(rùn)性γδT細(xì)胞表現(xiàn)為功能抑制表型、激活性受體(NKG2D)表達(dá)下調(diào)、體外非特異性及特異性殺傷功能均明顯減弱;肝細(xì)胞癌內(nèi)γδT細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells; Treg細(xì)胞）間明顯負(fù)相關(guān)，Treg細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、白介素10依賴途徑抑制γδT細(xì)胞的殺傷功

7、能[15]。目前雖然對(duì)γδT細(xì)胞的角色認(rèn)識(shí)不斷深入，但對(duì)于γδT細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后價(jià)值尚未闡明;肝細(xì)胞癌浸潤(rùn)性γδT細(xì)胞功能減弱的內(nèi)在機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。
　　很多研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化家族（Histone deacetylases; HDACs）抑制劑可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性抗原(major histocompatibility antigen;MHC)表型I-相關(guān)性A鏈和B鏈(MHC classⅠ-

8、related chain A and B; MICA/B)，使得腫瘤細(xì)胞易于被NK細(xì)胞識(shí)別并殺傷，這一殺傷過(guò)程主要通過(guò)NKG2D來(lái)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)[16]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)鼠類行HDAC抑制劑干預(yù)，可對(duì)腫瘤起到抑制的作用[17]。令我們感興趣的是，NKG2D主要表達(dá)在自然殺傷細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞和γδT細(xì)胞上，在腫瘤抗原識(shí)別、腫瘤細(xì)胞殺傷中發(fā)揮重要作用[18]。我們前期研究亦表明該受體在肝癌浸潤(rùn)性γδT細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)[15]。這提示H

9、DACs抑制劑可能參與了肝細(xì)胞癌浸潤(rùn)性γδT細(xì)胞功能減弱，具體的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。
　　表觀遺傳修飾在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、生命周期和腫瘤形成方面都發(fā)揮重要作用[19]。其中，乙?；揎棇?duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞許多生物功能起著關(guān)鍵作用[20-21]。HDACs包括四大類，其中第三類為Sirtuins，與其他家族成員不同的是，它們是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide，NAD)依賴性的，不能被其他類

10、成員抑制劑所抑制[21]。它的生物活性由[NAD+]/[NADH]比值所決定，具體而言，[NAD+]是激活劑，[NADH]是抑制劑。Sirtuins是廣泛表達(dá)在生物界的一個(gè)家族，小到細(xì)菌，大到人類均存在表達(dá)，是酵母沉默調(diào)節(jié)因子2(yeast silentinformation regulator2;Sir2)的異構(gòu)體。Sirtuins的效應(yīng)目標(biāo)亦包括眾多非組蛋白，沒(méi)有一定的特異性和選擇性，反應(yīng)形式主要表現(xiàn)為去乙?；虯DP-核糖基化[2

11、2]。兩種反應(yīng)形式均以NAD+的裂解為起始反應(yīng)，兩者不同之處在于Sirt1，Sirt2，Sirt3，Sirt5，Sirt7對(duì)目的蛋白賴氨酸殘端進(jìn)行去乙?；?，以NAD+作為輔因子，反應(yīng)結(jié)果是釋放一分子尼克酰胺和一分子2'-O-乙?；?ADP核糖。與此相反的是，Sirt4和Sirt6進(jìn)行的是ADP-核糖基化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果是將底物行ADP核糖基化[22]。
　　近年來(lái)Sirtuins越來(lái)越備受關(guān)注，發(fā)現(xiàn)其在眾多生物過(guò)程中充當(dāng)重要角色，包

12、括調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，調(diào)控細(xì)胞增殖和生存，耐受應(yīng)激和凋亡。Sirtuins在代謝類疾病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥性疾病，尤其是腫瘤中均扮演重要的角色[21]。Sirt1作為Sir2最同源性結(jié)構(gòu)的成員，在急性髓性白血病、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、非惡性皮膚瘤中發(fā)揮作用。但是Sirt1因不同類型腫瘤，不同腫瘤發(fā)展階段而扮演不同的角色，存在促癌和抑癌兩面性[23-24]。同樣，其他Sirtuins成員在乳腺癌、胰腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)亦與

13、腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系[25-26]。因此對(duì)于腫瘤中表達(dá)失控的Sirtuins成員，利用Sirtuins抑制劑可能對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到一定的抑制作用，具有較為明顯的臨床意義。但目前對(duì)于Sirtuins在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)特點(diǎn)以及與肝癌的生物學(xué)特性關(guān)系尚未闡明。
　　本課題以肝細(xì)胞癌為主要研究對(duì)象:一、從γδT細(xì)胞入手，前期工作發(fā)現(xiàn)，γδT細(xì)胞在外周血中比例較低，但在肝臟中大量浸潤(rùn)，而肝細(xì)胞癌中浸潤(rùn)卻較癌旁肝組織中明顯降低;

14、肝細(xì)胞癌浸潤(rùn)性γδT細(xì)胞表現(xiàn)為功能抑制表型、殺傷功能明顯減弱;肝細(xì)胞癌內(nèi)γδT細(xì)胞與Treg細(xì)胞間明顯負(fù)相關(guān)，Treg細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)、白介素10(Interleukin10;IL-10)依賴途徑抑制γδT細(xì)胞的殺傷功能[15]。本課題我們利用組織芯片(TissueMicroarray; TMA)行γδT細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistr

15、y, IHC），進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)，探討了γδT細(xì)胞在肝癌組織中的分布及與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)癌旁γδT細(xì)胞的數(shù)量與肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)息息相關(guān);二、利用肝癌患者的癌組織與癌旁組織，對(duì)γδT細(xì)胞的功能性指標(biāo)與Sirtuins家族表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，探討兩者之間相互作用的分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)癌中γδT細(xì)胞表達(dá)的NKG2D，穿孔素與Sirtuins家族中Sirt3的表達(dá)水平密切相關(guān)。三、從HDACs調(diào)控表觀遺傳學(xué)修飾出發(fā)，利用組織芯片免疫組織化學(xué)染色

16、，及凍存肝癌及癌旁組織免疫印跡(Western blotting，WB)分析，探討內(nèi)源性Sirtuins在塑造肝細(xì)胞癌中的作用。我們發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌表達(dá)的Sirt3與肝癌預(yù)后相關(guān)，并且在早期肝癌患者中的預(yù)后價(jià)值最大。四、利用慢病毒過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲等方面，探討了Sirt3在肝癌發(fā)生發(fā)展中充當(dāng)?shù)慕巧?。發(fā)現(xiàn)Sirt3在抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤凋亡，抑制腫瘤遷移和侵襲方面均發(fā)揮相應(yīng)作用。
　　第一部分γ

17、δT細(xì)胞在肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后價(jià)值
　　本研究旨在通過(guò)探討γδT細(xì)胞在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)情況及與肝癌生物學(xué)特性的相關(guān)性，研究γδT細(xì)胞在肝細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值。
　　通過(guò)對(duì)大樣本肝細(xì)胞癌建立的組織芯片行免疫組織化學(xué)染色，對(duì)癌及癌旁γδT細(xì)胞分別進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)，通過(guò)“最小P值法”得到最佳界值個(gè)數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析γδT細(xì)胞在肝細(xì)胞癌患者肝癌組織，癌旁組織中的表達(dá)，可得到γδT細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目與肝癌預(yù)后及臨床病理特征間的關(guān)系。
　　結(jié)果

18、發(fā)現(xiàn)，癌組織中γδT細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，癌旁γδT細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量增多。癌與癌旁組織γδT細(xì)胞與腫瘤的大小呈明顯相關(guān)性(癌，P=0.022;癌旁，P=0.005)。通過(guò)單因素分析，癌旁γδT細(xì)胞浸潤(rùn)個(gè)數(shù)減少與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和總體生存率呈明顯相關(guān)性(TTR，P=0.010; OS，P=0.036);通過(guò)多因素分析，癌旁γδT細(xì)胞浸潤(rùn)與肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)明顯相關(guān)，總體生存率無(wú)明顯相關(guān)（TTR，P=0.014; OS，P=0.279）。另對(duì)癌旁γδT細(xì)

19、胞進(jìn)行多因素分層分析得到在BCLC早期肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)中具有明顯預(yù)后價(jià)值(TTR，P=0.038;OS，P=0.231)。此外癌組織中γδT細(xì)胞僅在單因素分析后與總體生存率相關(guān)(TTR，P=0.599;OS，P=0.038)。
　　癌旁γδT細(xì)胞的浸潤(rùn)與肝細(xì)胞癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)，這也提示癌旁也是導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)的主要因素之一，也提示γδT細(xì)胞可作為肝癌免疫治療，作為預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的重要手段之一。
　　第二部分γδT細(xì)胞功能

20、性指標(biāo)與Sirtuins家族表達(dá)的相關(guān)性研究
　　本研究旨在通過(guò)對(duì)γδT細(xì)胞功能性指標(biāo)與Sirtuins家族表達(dá)的相關(guān)性研究，探討Sirtuins家族對(duì)肝癌中γδT細(xì)胞浸潤(rùn)減少與功能缺陷的影響。
　　通過(guò)利用13例患者的新鮮癌及癌旁組織，分離并純化γδT細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分析γδT細(xì)胞的功能表型（包括NKG2D表達(dá)、Perforin及Granzyme B表達(dá)、γ干擾素（Interferon-γ; IFN-γ）表達(dá)），采用W

21、B檢測(cè)Sirtuins家族蛋白表達(dá)水平，然后進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，以期發(fā)現(xiàn)兩者間的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究提供指導(dǎo)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sirtuins中的Sirt3的表達(dá)水平與癌γδT細(xì)胞的功能性指標(biāo)NKG2D及穿孔素具有明顯的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NKG2D，P=0.0024;穿孔素，P=0.020)。
　　這提示Sirt3可能在一定程度上參與了癌組織中γδT細(xì)胞功能受損，值得進(jìn)一步研究。
　　第三部分 Sirtui

22、ns的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)研究
　　本研究旨在通過(guò)明確Sirtuins家族成員在肝細(xì)胞癌及癌旁的表達(dá)情況及與肝癌生物學(xué)特性的相關(guān)性，探討Sirtuins在肝細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值。
　　Sirtuins家族包括七個(gè)成員，是在生物體中廣泛存在并高度保守表達(dá)的一組蛋白，主要對(duì)靶蛋白進(jìn)行去乙?；瑓⑴c細(xì)胞周期，細(xì)胞分裂，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和機(jī)體代謝等重要功能。研究提示Sirtuins家族在維持基因表達(dá)的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)生命周期方面均發(fā)揮關(guān)鍵

23、作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn)Sirtuins在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦扮演重要角色。Sirt3是Sirtuins家族中的一員，主要定位于線粒體，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中異常表達(dá)，但在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及預(yù)后價(jià)值不甚清楚。我們擬通過(guò)免疫組化及免疫印跡，分析Siruins在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，得到Siruins與肝癌預(yù)后及臨床病理特征間的關(guān)系。
　　IHC與WB結(jié)果均表明Sirt3在癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(IHC:P=0.003; WB:P

24、=0.0042)。多因素分析后，癌組織中的Sirt3低表達(dá)與肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)及肝癌患者總體生存率密切相關(guān)（TTR，P=0.031; OS，P=0.001），并且在BCLC早期患者中亦具有預(yù)后價(jià)值(TTR，P=0.011; OS，P＜0.001)。此外，經(jīng)多因素分析后Sirt3在癌旁中的低表達(dá)亦與肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后相關(guān)（TTR，P=0.047; OS，P=0.031）。Sirtuins家族其他六個(gè)成員未表現(xiàn)出顯著的肝癌預(yù)后價(jià)值。
　

25、　本研究表明癌與癌旁Sirt3可作為肝細(xì)胞癌術(shù)后患者不良預(yù)后的有效指標(biāo)，并在BCLC早期患者中具有預(yù)后價(jià)值，并可指導(dǎo)臨床醫(yī)生為患者制定更為合理的治療方案。
　　第四部分 Sirt3在肝細(xì)胞癌中的功能研究
　　本研究旨在建立慢病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Sirt3肝癌細(xì)胞株，并且通過(guò)細(xì)胞功能試驗(yàn)來(lái)闡述Sirt3如何對(duì)肝細(xì)胞癌的預(yù)后產(chǎn)生影響。
　　Sirt3是Sirtuins家族中的重要成員，主要定位于線粒體，在細(xì)胞代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用

26、，近來(lái)發(fā)現(xiàn)Sirt3亦參與腫瘤細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)。我們通過(guò)組織芯片發(fā)現(xiàn)Sirt3在肝癌中表達(dá)明顯下調(diào)，且具有明顯的預(yù)后價(jià)值，能夠影響肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)和總體生存率。本部分我們則通過(guò)綠色熒光蛋白(GFP)耦聯(lián)的慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。通過(guò)細(xì)胞凋亡試驗(yàn)，細(xì)胞增殖試驗(yàn)，劃痕試驗(yàn)，遷移和侵襲試驗(yàn)來(lái)探討Sirt3如何影響肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
　　通過(guò)TUNEL細(xì)胞凋亡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞株能夠一定程度上促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

27、CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)提示過(guò)表達(dá)Sirt3細(xì)胞株(SMMC7721)能夠抑制肝癌細(xì)胞的數(shù)量增多;劃痕試驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn)提示過(guò)表達(dá)Sirt3可以一定程度上抑制肝癌細(xì)胞遷移;Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)提示過(guò)表達(dá)Sirt3可以一定程度上抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　過(guò)表達(dá)Sirt3可促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞凋亡，一定程度上抑制SMMC7721細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲的能力。
　　結(jié)論
　　1.通過(guò)多因素

28、生存分析，肝細(xì)胞癌旁γδT浸潤(rùn)與肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)。
　　2.通過(guò)相關(guān)性分析，肝細(xì)胞癌中γδT表達(dá)的功能性指標(biāo)NKG2D和穿孔素與癌Sirt3的表達(dá)具有明顯相關(guān)性。
　　3.通過(guò)多因素生存分析，肝細(xì)胞癌及癌旁Sirt3表達(dá)與肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)及總體生存率相關(guān)，且癌中Sirt3表達(dá)與BCLC A期患者預(yù)后相關(guān)。
　　4.通過(guò)肝癌細(xì)胞株體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sirt3在促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞增殖，抑制腫瘤遷移和侵襲方面