肝細胞癌內(nèi)γδT細胞浸潤減少及功能缺陷的機制研究.pdf

1、本課題從肝細胞癌內(nèi)γδT細胞浸潤減少及效應功能受抑制的基本現(xiàn)象出發(fā)，研究γδT細胞效應功能受抑制的內(nèi)在分子機制。本研究闡明了肝癌局部免疫抑制分子與γδT細胞作用的內(nèi)在機制，豐富免疫逃逸理論，揭示腫瘤局部γδT細胞功能抑制的內(nèi)在機制，對完善以γδT細胞為基礎(chǔ)的免疫治療策略以及探尋恰當?shù)拿庖咧委煵呗杂泻艽蟮拇龠M作用。
　　第一部分 肝細胞癌內(nèi)γδT細胞浸潤減少及功能缺陷的研究
　　本研究旨在探索γδT細胞在肝細胞癌患者體內(nèi)不同部

2、位中（外周血、癌旁肝組織、肝癌病灶）的分布與和功能。
　　通過不連續(xù)密度梯度離心法分離同一肝癌患者外周血單核細胞、癌旁浸潤淋巴細胞(Peritumor infiltrating lymphocytes; PILs)及肝癌浸潤淋巴細胞(Tumorinfiltrating lymphocytes; TILs)，借助流式細胞技術(shù)分析不同部位γδT細胞分布及表型差異;借助RT-PCR技術(shù)分析不同部位γδT細胞表型差異;利用免疫組織化學染色

3、分析肝癌組織及癌旁組織中γδT細胞浸潤特點及絕對計數(shù)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌患者γδT細胞在配對的癌旁肝組織高于外周血（13.22±8.44％vs12.96±8.82％，mean±SD; P=0.046），在肝癌組織中的浸潤明顯低于配對的癌旁肝組織（13.22±8.44％vs6.33±5.61％，mean±SD;P=0.0002）。免疫組化染色顯示γδT細胞在實質(zhì)區(qū)及間質(zhì)區(qū)均有浸潤;通過比較癌與癌旁單位面積中TCRG+細胞計數(shù)，發(fā)現(xiàn)肝癌內(nèi)T

4、CRG+細胞浸潤明顯減少，癌旁肝組織明顯高于癌內(nèi)（17.10±11.25 vs4.42±15.40，mean±SD;P＜0.001）。肝癌組織中γδT細胞表達IL-12Rb1、IL-12Rb2和IL-18Ra比例，與配對的癌旁肝組織無明顯差異，表達IL-18Rb的比例，癌內(nèi)相對配對的癌旁肝組織有明顯下降;CCL18和CD276mRNA癌內(nèi)表達明顯高于癌旁，而CD40 ligend和Fas ligend mRNA癌內(nèi)表達明顯低于癌旁。

5、r>　　本實驗表明肝癌組織內(nèi)γδT細胞浸潤較癌旁組織明顯減少及功能缺陷。
　　第二部分 肝細胞癌內(nèi)高、低γδT細胞浸潤組趨化因子和細胞因子表達研究
　　本研究目的是探索肝細胞癌高、低γδT細胞浸潤組趨化因子和細胞因子表達差異。
　　通過不連續(xù)密度梯度離心法分離同一肝癌患者癌旁浸潤淋巴細胞(Peritumor infiltrating lymphocytes; PILs）及肝癌浸潤淋巴細胞(Tumor infiltrat

6、ing lymphocytes;TILs)，借助流式細胞技術(shù)分析不同部位γδT細胞表達;利用RayBio HumanAntibody Array檢測趨化因子和細胞因子和γδT細胞浸潤相關(guān)性及表達差異。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)274個檢測指標中，12個趨化因子蛋白癌內(nèi)相對癌旁上調(diào)，2個趨化因子癌內(nèi)相對癌旁下調(diào)，10個細胞因子癌內(nèi)相對癌旁上調(diào)，29個未分類因子癌內(nèi)相對癌旁上調(diào)，10個因子癌內(nèi)相對癌旁下調(diào)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CCL20與癌內(nèi)γδT細胞負

7、相關(guān)，Acrp30、MIP-3beta、ENA-78、FAS、b-NGF、MMP-8、MIF、MICB、IL-8、IL-6R、VCAM-1、TIMP-1、TIMP-2、PDGF-BB、GRO、GRO-alpha和HGF與之正相關(guān)。MSP-3-alpha與癌旁γδT細胞正相關(guān)。
　　綜上所述γδT細胞浸潤高低和肝癌內(nèi)、癌旁多種細胞因子和趨化因子表達異常有關(guān)。
　　第三部分 TSLP、CCL5和Foxp3陽性細胞與γδT細胞的相

8、關(guān)性研究
　　本研究目的是探索肝細胞癌患者TSLP、CCL5和Foxp3陽性細胞與γδT細胞表達相關(guān)性。
　　通過免疫組織化學方法分析TSLP、CCL5和Foxp3與γδT細胞表達差異及相關(guān)性。
　　分析后發(fā)現(xiàn)γδT細胞與Foxp3陽性細胞在癌內(nèi)無相關(guān)性，在癌旁卻呈正相關(guān)。TSLP與癌內(nèi)γδT細胞兩者間存在負相關(guān)性。TSLP和CCL5與Foxp3的表達無相關(guān)性。
　　TSLP和CCL5對γδT細胞異常分布有重要作

9、用。
　　第四部分 轉(zhuǎn)錄因子Eomes與肝癌預后的相關(guān)研究
　　轉(zhuǎn)錄因子Eomes是介導IFN-γ分泌的重要轉(zhuǎn)錄因子，其表達異常與淋巴細胞的激活和分化有重要相關(guān)性。本研究旨在通過分析Eomes與肝癌患者預后及淋巴細胞亞群的相關(guān)性，探討轉(zhuǎn)錄因子在塑造肝細胞癌免疫微環(huán)境中的作用。
　　通過組織芯片免疫組織化學染色，分析Eomes在331例肝癌組織及癌旁組織中的表達情況。結(jié)果顯示，Eomes陽性細胞主要在分布在腫瘤間質(zhì)中。相

10、對于癌旁組織，癌組織中的γδT細胞浸潤程度明顯減少(平均值，28.60 vs.67.75，P＜0.0001)。陽性計數(shù)后利用“最小P值法”得到最佳臨界Eomes個數(shù)，癌旁為15，癌為10。可將病例分成癌旁高浸潤組(n=293)及低浸潤組(n=38);癌內(nèi)高浸潤組(n=168)及低浸潤組(n=163)。
　　單因素預后分析發(fā)現(xiàn)，癌旁Eomes陽性細胞低浸潤組總體生存率(OverallSurvival; OS)低于癌旁高浸潤組(OS，

11、P=0.009)，復發(fā)時間(Time to recurrence;TTR，P=0.292)無明顯差異。將有意義的臨床病理特征因素與癌旁Eomes陽性細胞納入COX風險比例模型中進行多因素分析，結(jié)果顯示癌旁Eomes是肝癌患者OS的獨立預測指標(P=0.028)。另外我們發(fā)現(xiàn)癌旁Eomes陽性細胞亦可作為BCLC患者OS的獨立預測指標(P=0.006)。同時，我們對癌內(nèi)細胞進行單因素預后分析，發(fā)現(xiàn)癌內(nèi)Eomes陽性細胞低浸潤組OS低于高浸

12、潤組(OS，P=0.018;TTR，P=0.338)。將有意義的臨床病理特征因素納入COX風險比例模型中進行多因素分析，結(jié)果顯示癌內(nèi)Eomes陽性細胞不是肝癌患者OS的獨立預測指標(P=0.374)。另外我們發(fā)現(xiàn)癌內(nèi)Eomes陽性細胞亦非BCLC患者OS的獨立預測指標，分析結(jié)果為(P=0.328)。運用流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，不同部位轉(zhuǎn)錄因子Eomes表達比例有明顯差別，γδT細胞和CD3+CD56-亞群表達比例癌內(nèi)相對于癌旁有明顯降低。