Ferroportin抑制肝細(xì)胞癌生長的機(jī)制研究.pdf

1、目的:鐵是維持正常細(xì)胞功能必不可少的物質(zhì)。多種惡性腫瘤表現(xiàn)出對鐵的需求增加，可能是鐵可以作為某些蛋白質(zhì)的輔助因子參與維持細(xì)胞的生長和增殖。
　　Ferroportin又被稱為溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族40成員1。Ferroportin主要表達(dá)在網(wǎng)狀造血系統(tǒng)、十二指腸、脾臟、肝臟、腎臟和心臟，胚胎外胚層也有表達(dá)。這些系統(tǒng)和鐵代謝密切相關(guān)。亞細(xì)胞定位表明，F(xiàn)erroportin主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，包括肝細(xì)胞、腎小球上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、十二

2、指腸上皮細(xì)胞。Ferroportin主要功能為將細(xì)胞內(nèi)的鐵輸送到細(xì)胞外，參與鐵的吸收和維持鐵代謝的平衡。但Ferroportin只是負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的鐵輸送到細(xì)胞外，而細(xì)胞外的鐵進(jìn)入細(xì)胞則是其他蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)。
　　Ferroportin是體內(nèi)鐵代謝的關(guān)鍵所在，F(xiàn)erroportin的表達(dá)高低控制著細(xì)胞內(nèi)鐵水平的高低。Ferroportin表達(dá)水平受到至少三個機(jī)制調(diào)控:轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控;翻譯水平調(diào)控;蛋白水平調(diào)控，特異性的和鐵調(diào)素hepcid

3、in結(jié)合，使ferroportin降解。其中hepcidin是目前唯一被證實的Ferroportin的配體，hepcidin和Ferroportin結(jié)合后使ferroportin磷酸化而介導(dǎo)ferroportin內(nèi)化，并通過蛋白酶降解。
　　肝細(xì)胞癌(HCC)是一種惡性程度很高的腫瘤，是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一。我國的肝細(xì)胞癌的發(fā)病率在惡性腫瘤發(fā)病率中排名第四，為每十萬人口約為23.5例，而死亡率居惡性腫瘤死亡率的第2位

4、。加之HBV和HCV感染的不斷發(fā)展，HCC的發(fā)病率在西方國家也在不斷增長。到目前為止，很多研究均顯示HCC中存在許多基因畸變表達(dá)。
　　Ferroportin在肝細(xì)胞高水平表達(dá)，肝臟又是鐵代謝的關(guān)鍵器官。本研究通過檢測臨床病例標(biāo)本中Ferroportin蛋白在肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平;進(jìn)一步通過細(xì)胞生物學(xué)實驗研究分析Ferroportin蛋白和肝癌細(xì)胞惡性行為的關(guān)系，同時通過分子生物學(xué)的實驗研究其具體分子機(jī)制;從而初步闡明Ferr

5、oportin蛋白在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的機(jī)制及其意義。
　　方法:采用免疫組織化學(xué)染色檢測60例HCC的在組織、癌旁肝組織和10例正常肝組織樣本中Ferroportin的表達(dá)水平及分析Ferroportion的表達(dá)水平與HCC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。進(jìn)一步通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株，提高了肝癌細(xì)胞株MHCC-97H的Ferroportin蛋白的表達(dá);運(yùn)用生長曲線、MTT實驗、劃痕實驗、基質(zhì)膠侵襲實驗研究Ferroportin蛋

6、白對高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，及采用熒光測量法檢測了Ferroportin對細(xì)胞可變鐵池(LIP)的影響。最后通過熒光定量PCR和Western-blot證實了Ferroportin在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)的原因。
　　結(jié)果:免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示:
　　(1)Ferroportin在正常肝組織、癌旁組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜都表現(xiàn)出強(qiáng)陽性表達(dá)。而在大多數(shù)肝細(xì)胞癌組織只有一小部分呈弱陽性。統(tǒng)計分析HCC組織內(nèi)的Ferroport

7、in蛋白表達(dá)陽性率和評分分別為28.3％(17/60)、0.96±0.31;在癌旁組織中Ferroportin蛋白表達(dá)陽性率和評分分別為91.17％(55/60)、5.97±2.12;在正常肝組織中Ferroportin蛋白表達(dá)陽性率和評分分別為100％(10/10)、6.38±2.59。
　　(2)統(tǒng)計分析60例HCC患者的Ferroportin的表達(dá)水平與其臨床病理學(xué)特征的關(guān)系顯示:肝癌伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的Ferroportin蛋白

8、表達(dá)陽性表達(dá)率和陽性評分分別為16.67％，0.69±0.33;不伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移其陽性表達(dá)率和陽性評分分別為31.25％，1.03±0.43，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。伴有門靜脈侵潤的Ferroportin蛋白表達(dá)陽性表達(dá)率和評分分別為9.10％，0.72±0.28;不伴有門靜脈侵潤其陽性表達(dá)率和評分分別為66.67％，1.03±0.47，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Ferroportin表達(dá)和肝癌細(xì)胞的Edmondson-Steiner分

9、級的關(guān)系:Ⅲ～Ⅳ期組中，F(xiàn)erroportin蛋白的陽性表達(dá)率和陽性評分分別為20.00％，0.73±0.32;而在Ⅰ～Ⅱ期組中，其陽性表達(dá)率和陽性評分分別為35.29％，1.14±0.49，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。肝癌的TNM分期與Ferroportin蛋白表達(dá)之間也存在相似的相互關(guān)系。Ⅲ～Ⅳ期組中，F(xiàn)erroportin蛋白的陽性表達(dá)率和陽性評分分別為19.23％，0.73±0.33;而在Ⅰ～Ⅱ期組中，其陽性表達(dá)率和陽性評分分別為

10、35.79％，1.15±0.45，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Ferroportin蛋白表達(dá)跟AFP水平之間沒有明顯的關(guān)系,無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　Ferroportin在肝癌細(xì)胞系、正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)情況:Western-blot實驗顯示:Ferroportin在各肝細(xì)胞癌細(xì)胞株表達(dá)明顯減低，而肝正常細(xì)胞系中則表達(dá)增高，之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而肝癌細(xì)胞株中MHCC-97H中Ferroportin表達(dá)最低。成功構(gòu)建了Ferropo

11、rtin真核表達(dá)載體，并鑒定和Western-blot驗證后將其轉(zhuǎn)染入MHCC-97H細(xì)胞株中。
　　生長曲線實驗表明:轉(zhuǎn)染了Ferroportin后，第1到4天的細(xì)胞生長數(shù)分別為:16750±5212、23445±6198、48377±4768、91642±7698，與對照組和未處理組比較之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組第1到4天的細(xì)胞生長數(shù)分別為:21563.9±5860、47344.4±6379、89561.1±4870、155

12、862±7980;未處理組第1到4天的細(xì)胞生長數(shù)分別為:22342±5490、45244±6523、90124±5062、149782±7120，二者之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　MTT實驗結(jié)果顯示:Ferroportin轉(zhuǎn)染組0-96小時吸光率分別為:0.175±0.0447、0.267±0.0451、0.437±0.0567、0.765±0.0788、1.134±0.0853;而對照組24-96小時吸光率分別為:0.198±

13、0.0479、0.356±0.0675、0.872±0.0345、1.421±0.0933、1.748±0.1012;未處理組的24-96小時吸光率分別為:0.202±0.0564、0.362±0.0764、0.843±0.0671、1.453±0.1392、1.752±0.1132。實驗組與未處理組和對照組比較之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而未處理組與對照組比較之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　抑制率曲線顯示:未處理組與對照組培養(yǎng)各時間的抑

14、制率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;三組細(xì)胞株培養(yǎng)0小時的抑制率無統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組與另外兩組細(xì)胞株的抑制率比較24小時后的各時間點抑制率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，96h較72小時比較抑制率增加，但二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。并培養(yǎng)72小時時的抑制率為31.12±7.87，抑制率＞0.3，藥敏試驗陽性。
　　劃痕實驗實驗顯示:Ferroportin轉(zhuǎn)染組36小時細(xì)胞運(yùn)動距離為268.0±28.94微米，而未處理組和對照組36小時細(xì)胞運(yùn)動距離分

15、別為483.0±24.08微米、479.0±23.18微米。實驗組的遷移運(yùn)動能力和未處理組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　基質(zhì)膠侵襲實驗顯示:未處理組、對照組中MHCC-97H細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)為每個視野平均172.0±33.43、162.0±30.43個;而轉(zhuǎn)染Ferroportin后，MHCC-97H細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，每個視野平均28.0±10.67個，實驗組與未處理組、對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　熒

16、光測量法檢測胞可變鐵池(LIP)結(jié)果表明:未處理組、對照組MHCC-97H的LIP分別為0.3857±0.086、0.3746±0.091rfu;而實驗組MHCC-97H細(xì)胞的LIP為0.1238±0.076rfu。實驗組和未處理組、對照組比較，二者比較具有顯著性差異。
　　Western-blot檢測Hepcidin對Ferroportin表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)可變鐵池LIP的影響顯示:
　　(1)分別使用0nM、300nM、70

17、0nM濃度的Hepcidin處理轉(zhuǎn)染了Ferroportin的MHCC-97H細(xì)胞，F(xiàn)erroportin的表達(dá)量分別為1.102±0.457，0.479±0.213，0.164±0.087，300nM、700nM組和0nM組Ferroportin的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，300nM與700nM組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)測定0nM、300nM、700nM濃度的Hepcidin處理實驗組MHCC-97H細(xì)胞中的LIP，

18、0nM、300nM、700nM Hepcidin處理后的LIP分別為0.1312±0.069、0.2576±0.081、0.3913±0.072，300 nM、700nM組和0 nM組LIP比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，300nM與700nM組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　RT-PCR檢測BMP/Smad信號通路對Ferroportin表達(dá)的影響:
　　(1)不同種類BMP因子對Hepcidin表達(dá)結(jié)果顯示未使用BMP處理的，其Hep

19、cidin表達(dá)量比為0.978±0.145; BMP2、BMP4、BMP6處理后Hepcidin表達(dá)量比分別為:13.2600±1.2450、12.9340±1.3670、14.2300±2.1560;而使用BMP抑制劑組Hepcidin表達(dá)量比為0.0560±0.2360。BMP2、BMP4、BMP6處理后Hepcidin表達(dá)量與未使用BMP處理的、BMP抑制劑組Hepcidin表達(dá)量之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　(2)熒光定

20、量PCR檢測BMP2處理不同時間的Hepcidin的表達(dá)的結(jié)果表明:BMP2處理后0.5、1、2、4、6、12小時Hepcidin表達(dá)量比依次為1.423±0.356、2.534±0.215、5.871±0.534、8.314±1.098、14.23±1.230、18.240±1.780，各時間點之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　Western-blot檢測BMP2、BMP4、BMP6處理MHCC-97H細(xì)胞后Ferroporti

21、n表達(dá)情況:使用BMP2、BMP4、BMP6處理MHCC-97H細(xì)胞后其信號通路下游磷酸化的Smad(1/3/5)磷酸化程度明顯增加，而使用BMP抑制劑組Smad(1/3/5)的磷酸化被明顯抑制，BMP2、BMP4、BMP6處理后Hepcidin表達(dá)量與未使用BMP處理的、BMP抑制劑組Ferroportin表達(dá)量之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但是BMP家族成員2、4、6處理的Hepcidin表達(dá)量之間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:

22、
　　1.Ferroportin在肝癌細(xì)胞中表達(dá)缺失和降低，F(xiàn)erroportin的表達(dá)和Edmondson-Steiner分級、TNM分期、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及門靜脈侵潤相關(guān)。
　　2.Ferroportin在肝細(xì)胞癌細(xì)胞株表達(dá)明顯減低，在肝正常細(xì)胞株中表達(dá)增高。
　　3.成功構(gòu)建了Ferroportin真核表達(dá)載體。
　　4.在MHCC-97H細(xì)胞株中，F(xiàn)erroportin的表達(dá)水平升高可以明顯抑制MHCC-97H